Mecanismos epigenéticos em leiomiomas uterinos e o efeito da mifepristona (RU 486) na expressão gênica dos receptores de progesterona total e B

Abstract

Introdução: Leiomiomas uterinos ou miomas são tumores benignos que se desenvolvem no miométrio e acometem cerca de 50% da população feminina. Têm como principais sintomas, sangramento excessivo e dor pélvica inespecífica. Convencionalmente o estrogênio é considerado o responsável pelo início da proliferação tumoral, mas recentes evidências clínicas e bioquímicas sugerem que a progesterona apresenta um papel importante no desenvolvimento desses tumores. Além disso, mecanismos epigenéticos parecem estar envolvidos na etiologia dos leiomiomas uterinos, como a metilação de DNA e acetilação de histonas. Somente nos EUA são realizadas 240 mil histerectomias/ano para tratar essa doença sendo considerado um problema de saúde pública. Frente a esses dados é imprescindível o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento desses tumores e a busca de tratamentos menos invasivos. A mifepristona (RU 486), um modulador seletivo dos receptores de progesterona e glicocorticoides, é capaz de diminuir o tamanho dos tumores e amenizar os sintomas associados. Objetivos: verificar se (1) nos tecidos de leiomiomas uterinos e miométrio, os mecanismos epigenéticos como a metilação global do DNA e a acetilação de histonas estão alterados (2) se em cultura primária de leiomioma uterino e miométrio o tratamento com estradiol e progesterona é capaz de modular a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B, assim como a atividade das enzimas histona acetiltransferase e desacetilase, e (3) se a mifepristona (RU 486) é capaz de modular diretamente a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B após tratamento com os hormônios estradiol e progesterona. Métodos: para análise de metilação global do DNA e acetilação de histonas foram utilizadas 25 amostras teciduais para cada grupo de leiomioma uterino e miométrio oriundos de pacientes submetidas à histerectomia no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A metilação global do DNA e a atividade da enzima histona acetiltransferase foram dosadas pelo método de ELISA e a enzima histona desacetilase por detecção fluorimétrica. Para verificar o efeito dos hormônios sexuais ovarianos e o efeito da mifepristona (RU 486) sobre a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B foram realizadas 7 culturas primárias de leiomiomas uterinos e miométrio. Resultados: (1) Foram observadas hipermetilação (P = 0,022) e hipoacetilação (P = 0,04) em leiomiomas uterinos quando comparado ao miométrio. Não houve diferença estatística entre estes tecidos em relação à atividade da histona acetiltransferase. (2) Houve aumento da expressão gênica do receptor de progesterona total em cultura primária de leiomioma uterino quando tratado com estradiol (P = 0,028) e o receptor de progesterona B teve sua expressão aumentada quando tratado com estradiol, progesterona e estradiol + progesterona (P = 0,001). (3) O tratamento com mifepristona (RU 486) na dose de 10-6M não foi capaz de diminuir a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B em células de leiomiomas uterinos e miométrio. A atividade da enzima histona desacetilase foi maior nas células de leiomioma uterino quando tratadas com estradiol (P = 0,034) e estradiol + progesterona + RU 486 (P = 0,001) quando comparado às células de miométrio, já a atividade da enzima histona acetiltransferase não foi detectada, devido a sua baixa quantidade. Conclusão: Nesse estudo foi observado uma hipermetilação e hipoacetilação nos tecidos de leiomiomas uterinos. Esses resultados sugerem que mecanismos epigenéticos podem estar contribuindo para a diminuição transcricional de genes relacionados ao funcionamento normal do miométrio e, com isso, colaborando para o crescimento desses tumores. Além disso, nossos resultados sugerem que estradiol e progesterona são capazes de modular a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B e o medicamento RU 486 na dose de 10-6M não foi capaz de diminuir diretamente a expressão desses receptores.

Introduction: Uterine leiomyoma, also known as fibroids, is a smooth muscle cell tumor, and is clinically apparent in up to 50% of reproductive-age women. Clinical symptoms include abnormal uterine bleeding and pelvic pain. Estrogen has been considered a primary growth promoter of uterine leiomyoma, however clinical and biochemical evidence has suggested that progesterone plays a critical role in the development of these tumors. Furthermore, epigenetic modifications may be involved with etiology of theses tumors, through DNA methylation and histone acetylation. In the United States, 240.000 hysterectomies/year are performed to treat uterine leiomyomas which is being considered to be a public public health problem. The understanding of molecular mechanisms involved in the development of uterine leiomyoma may provide not only opportunities for a diagnostic, but also generation of novel therapeutic approaches. The mifepristone (RU 486), a synthetic steroid that has affinity for progesterone and glucocorticoid receptors has been reported to induce regression of uterine leiomyoma and reduce the symptoms. Objective: verify if (1) DNA global methylation and histone acetylation patterns are altered in uterine leiomioma tissue compared with myometrium; (2) the treatment with estradiol and progesterone are able to modulated de gene expression of total and B progesterone receptors and histone acetylation patterns in primary culture of uterine leiomyoma cells and myometrium as well as (3) the mifepristone (RU 486) are able to modulate the gene expression of total and B progesterone receptors after the treatment with ovarian steroids hormones. Methods: DNA global methylation and histone acetylation patterns were analyzed in 25 tissue samples from uterine leiomioma and myometrium. The DNA global methylation and the activity of histone acetyltransferase were performed using ELISA method. In order to evaluate histone deacetylase activity fluorimetric detection was used. To verify the effect of estradiol and progesterone on total and B progesterone receptors gene expression, as well as the influence of RU486 on this parameters, seven cultured cells from uterine leiomyoma and myometrium cells were performed. Results: (1) Hypermethylation (p = 0.022) and hypoacetylation (p = 0.04) in uterine leiomioma tissues compared with myometrium were observed. There was no statistic difference between these tissues in histone acetyltransferase activity. (2) We observed increased gene expression of total progesterone receptor in culture cells of uterine leiomyoma when treated with estradiol (p = 0.028). There was an increase of B progesterone receptor mRNA when treated with hormones, estradiol and progesterone (p = 0.001). The treatment with RU 486 was not able to modulate progesterone receptors. The histone desacetilase activity was elevated in uterine leiomyoma cells when treated with estradiol (p = 0.034) and estradiol + progesterone + RU 486 (p = 0.001). The histone acetyltransferase activity was barely detectable. Conclusion: In our study we found hypermethylation and hypoacetylation in uterine leiomyoma tissues suggesting that this process may lead to a decreased transcriptional activity of important genes associated with normal myometrium function contributing to the development of these tumors. Furthermore, our results suggest that ovarian steroids hormones increase progesterone receptors expression, being mifepristone (RU 486) at dose of 10-6M unable to decrease total and B progesterone receptors in uterine leiomyoma cells.