Caracterização de partículas virais e RNA de dupla fita isolados do fungo entomopatogênico Matarhizium anisopliae

Abstract

Micovírus são freqüentemente encontrados infectando vários gêneros de fungos. Em alguns sistemas, bem caracterizados, foi demonstrada a interferência de genes virais com o fenótipo do fungo, sendo o caso melhor documentado a hipovirulência em fungos fitopatogênicos. Em nosso laboratório, seis linhagens de Metarhizium anisopliae, um fungo entomopatogênico usado no controle biológico de pragas importantes em agricultura, foram analisadas para a presença de dsRNA. Todas as linhagens foram isoladas de insetos e três apresentam dsRNA viral (linhagens Al, MS e RJ). Nosso objetivo é analisar a possível interferência dos micovírus (Ma V s) com a entomopatogenicidade de M anisopliae. Neste trabalho foram caracterizados três MaVs através de purificação em gradientes de CsCl, microscopia eletrônica, análise de proteínas, padrão eletroforético dos componentes dsRNA, sorologia e análise da homologia entre os componentes dsRNA individuais de um mesmo Ma V e entre os componentes dsRNA dos diferentes MaVs, utilizando sondas de cDNA. As partículas virais dos MaVs RJ, AI e MS são isométricas, com diâmetro médio de 3S nm e são separados em várias bandas em gradientes de CsCI nas densidades de flotação de 1,32 a 1,41 (MaV-RJ); 1,3S a 1,45 (MaV-Al) e 1,40 a 1,43 g/ml (MaV-MS). Espectros de absorção típicos de nucleoproteínas foram observados em todas estas bandas e nas preparações de micovírus. Após a dissociação das partículas virais foi observada a presença de componentes dsRNA com o mesmo perfil eletroforético obtido em extratos de micélio. Foi demonstrado que o ácido nucléico viral é composto por dsRNA, pela digestão enzimática específica e purificação em colunas de celulose CFll. MaV-RJ apresenta, pelo menos, treze componentes dsRNA, variando de 3,1 a 0,5 kb e um polipeptídeo majoritário do capsídeo de 46 kDa. Ma V-AI apresenta pelo menos, cinco componentes dsRNA variando de 4,1 a 1 kb e um polipeptldeo majoritário do capsídeo de 80 kDa. Ma V -MS é muito semelhante a Ma V -AI em relação ao componente dsRNA de 4,1 kb e polipeptídeo majoritário, entretanto apresenta um número menor de componentes dsRNA pequenos. Durante o desenvolvimento do trabalho, Ma V-AI e MaV-MS apresentaram um padrão instável de componentes dsRNA, progressivamente mais complexo em relação aos componentes dsRNA pequenos. Foi caracterizado um mutante estável (linhagem RJd), derivado espontaneamente da linhagem RJ que não apresenta os componentes dsRNA de maior peso molecular, tendo apenas os nove componentes menores presentes na linhagem parental RJ. Esta linhagem derivada, RJd, apresenta morfologia da colônia alterada, contudo não temos evidências experimentais para associar diretamente estas alterações com o padrão alterado de componentes dsRNA. Anticorpos policlonais foram produzidos contra os três Ma V s e mostramos que estes Ma V s são sorologicamente relacionados. Em testes de dupla difusão MaV-RJ reage com antisoro contra MaV-AL e MaV-M5 indicando relações sorológicas. Em Western, todos os polipeptídeos dos capsídeos dos três Ma V s, reagem com os antisoros contra MaV-Al e MaV-M5. Sondas de cDNA do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-Al hibridizam com os componentes de 4,1 kb de MaV-M5 e com os componentes dsRNA S2, M3 e Ml de MaV-RJ. Quando a sonda de cDNA é preparada a partir do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-M5 também ocorre hibridização com o componente dsRNA de mesmo tamanho de MaV-AL ~com o componente dsRNA S2 de MaV-RJ. Se conclui que os três micovírus são relacionados entre si em relação a pelo menos um componente dsRNA. Além disso, a análise de hibridização mostrou que existe homologia entre todos os componentes de Ma V-RJ mas sondas a partir do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-Al não hibridizam com nenhum outro componente da mesma linhagem. Nossas tentativas de transferir micovírus ou dsRNA a linhagens "livres de micovírus" utilizando biobalística falharam.

Micovirus are frequently found infecting severa! genus of fungi in nature. In some, well characterised systems, the interference of vira! genes with the fungai phenotype was demonstrated, as is the case of hypovirulence mediated by viral dsRNA in phytopathogenic fungi. In our laboratory, six strains of Metarhizium anisopliae, an entomopathogenic fungus used in biological control of agronomic important pests, were screened for the presence of dsRNA. The strains analysed were isolated from insects and three have vira! dsRNA (strains AI, M5 and RJ). We aim to access the possibility of interference o f micovirus (Ma V s) with the entomopathogenicity o f M anisopliae. In this work the Ma V s were characterised through purification by CsCl gradients, eletron microscopy, protein analysis, dsRNA pattem, serology and homology between individual dsRNA components within the same Ma V and among the Ma V s. The Ma V s parti eles are isometric, with an average diameter o f ca. 3 5 nm and are resolved into severa! bands in CsCl gradients at buoyant densities o f 1.32 to 1.41 (Ma V -RJ); 1.35 to 1.45 (MaV-Al) and 1.40 to 1.43 g/ml (MaV-M5). Absorbance spectra, typical of nucleoproteins, waS detected in ali vira! preparations. The vira! nucleic acid was shown to be dsRNA, by specific enzymatic digestions and celiulose-CF11 chromatography. Upon dissociation, the particles were shown to contain dsRNAs, with the same eletrophoretic pattem of dsRNA components as extracted from mycelium. MaV-RJ have, at least, thirteen dsRNA components, ranging from 3.1 to 0.5 kb and one major capsid polypeptide o f 46 kDa. Ma V -AI have, at least, five dsRNA components, ranging from 4.1 to 1 kb and one major capsid polypeptide of 80 kDa. MaV-M5 is very similar to MaV-Al, in respect to the dsRNA component of 4.1 kb and major polypeptide, however, has fewer smalier dsRNA components. During the development of the work, Ma V -Al and Ma V -MS displayed an unstable dsRNA pattem, progressively more complex in relation to the smaller components. A stable mutant (strain RJd), derived spontaneously from strain RJ, was characterised and it lacks some of the large dsRNA components and has only nine of the smali dsRNA components present in the parental strain RJ. This derived strain displays altered colony morphology, nevertheless we have no experimental data to associate these alterations directly to the altered dsRNA pattem. Polyclonal antibodies were produced against the three Ma V s and we show that the Ma V s are serologicaliy related to each other. In double-diffusion serological test Ma VRJ reacted with antiserum against MaV-Al and MaV-M5, indicating serological relationships. In Westem blot, ali capsid polypeptides of the three MaVs, reacted with both antiserum against MaV-Al and against MaV-M5. cDNA probes from the 4.1 kbdsRNA component of Ma V -Al hybridised with the 4.1 kb-dsRNA component from MaV-M5 and the S2, M3 and Ml-dsRNA components from MaV-RJ. Moreover, a cDNA probe from 4.1 kb-dsRNA component from MaV-M5 hybridised with both the 4.1 kb-dsRNA component from MaV-Al and S2-dsRNA component from MaV-RJ. lt was concluded that the three viroses are related to each other, at least in one dsRNA component. In addition, hybridisation analysis revealed sequence homology between all dsRNA components of MaV-RJ but probes from the 4.1 kb-dsRNA component from MaV-Al do not hybridise with any other dsRNA components of the same strain. Our attempts to transfer the Ma V s to different "free o f vírus" strains of M. anisopliae by biobalistic, using both micovirus and naked dsRNA, have failed.