Produção de etanol e xilitol por linhagens recombinantes de Saccharomyces cerevisiae e novas espécies de Spathaspora a partir de hidrolisados da casca de aveia e soja

Abstract

Os resíduos lignocelulósicos agroindustriais são substratos abundantes e de baixo custo para a produção de vários compostos de valor agregado como etanol e xilitol, por isso a importância de estudos para ampliar as formas de aproveitamento das pentoses e hexoses presentes nestas matérias primas. Em vista disso, o presente trabalho buscou estudar a composição e os processos de hidrólise ácida diluída e enzimática da casca de soja (Glycine max) e da casca de aveia (Avena sativa L), bem como avaliar a fisiologia e a capacidade de produção de metabólitos como etanol e xilitol por novas leveduras recombinantes e selvagens, a partir da fermentação destes hidrolisados. Na primeira etapa do estudo, testou-se diferentes concentrações de ácido sulfúrico em diferentes tempos de autoclave para o pré-tratamento e solubilização da fração de hemicelulose da mistura de casca de soja e casca de aveia, através do processo de hidrólise ácida diluída. A condição de 1 % de ácido em 40 minutos de autoclave foi escolhida para a obtenção do hidrolisado ácido para a fermentação. No sólido resultante do tratamento anterior, foram testadas duas enzimas, o extrato do fungo Penicillium echinulatum e a enzima comercial novozymes CELLUCLAST 1.5 ®, em três concentrações enzimáticas (10 FPU g-1,,15 FPU g-1, 20 FPU g-1).A enzima comercial novozymes CELLUCLAST 1.5 ®, na concentração de 15 FPU g-1 foi escolhida para a obtenção do hidrolisado enzimático pela maior liberação de açúcares no meio. Em uma segunda etapa, os hidrolisados ácido e enzimático e a mistura destes foram testados como meio de fermentação para duas linhagens recombinantes de Saccharomyces cerevisiae YRH 396 e YRH 400 que foram recombinadas por integração cromossômica dos genes da xilose redutase (XYL1), xilitol desidrogenase (XYL2) de Pichia stipitis e xiluloquinase (XKS1) de S. cerevisiae conferindo capacidade de metabolização da xilose. Nos ensaios em agitador orbital, a linhagem YRH 396 obteve parâmetros fermentativos (Yp/s e QP) superiores e teve seu metabolismo estudado em biorreator, apresentando valor de Yp/s de 0,39 gg-1 na fermentação do hidrolisado enzimático concentrado. Na fermentação do hidrolisado ácido em anaerobiose 71,2 % da xilose foi consumida com Yp/s (etanol) de 0,33 gg-1. Na fermentação do hidrolisado acido em um biorreator aerado com 1 vvm 64,3 % da xilose foi consumida com produção de 2,9 g L -1 de etanol e 8,17 g L -1 de xilitol. Em uma terceira etapa do trabalho, as novas espécies recentemente isoladas Spathaspora girioi e Spathaspora hagerdaliae foram testadas fermentando o hidrolisado ácido em anaerobiose e oxigênio limitado em agitador orbital. A fermentação pela espécie S. hagerdaliae foi escalonada em biorreator e apresentou Yp/s (etanol) de 0,32 gg-1 no cultivo em anaerobiose e Yx/x (xilitol) de 0,31 gg-1 em biorreator aerado.

Agroindustrial lignocellulosic residues are abundant, low-cost substrates for the production of various value-added compounds such as ethanol and xylitol. Therefore, the importance of extensive studies to increase the uses of pentoses and hexoses present in these raw materials. In this context, the present study sought to study the composition and the processes of diluted acid and enzymatic hydrolysis of soybean hulls and oat hulls, and to evaluate the physiology and production of ethanol and xylitol by new wild and recombinant yeast strains during fermentation of these hydrolysates. In the first stage of the study, different concentrations of sulfuric acid were tested in different autoclave times for the pre-treatment and solubilization of the hemicellulose fraction of the soybean hull and oat bark mixture through the diluted acid hydrolysis process. The condition of 1% acid in 40 minutes of autoclaving was chosen to obtain the hydrolysate resulting from the acid treatment for fermentation. In the solid resulting from the previous treatment, two enzymes, an extract of the fungus Penicillium echinulatum and the commercial enzyme CELLUCLAST 1.5 ® Novozymes, were tested in three enzymatic concentrations (10 FPU g-1,,15 FPU g-1, 20 FPU g-1).The commercial enzyme Novozymes CELLUCLAST 1.5 ® in the concentration of 15 FPU g-1 was chosen to obtain the enzymatic hydrolysate. In the second part, the acid and enzymatic hydrolysates and the mixture of these were tested as a fermentation medium for two recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae YRH 396 and YRH 400 that were recombined by chromosomal integration of the genes xylose reductase (XYL1), xylitol dehydrogenase (XYL2) di Pichia stipitis and xylulokinase (XKS1) genes of S. cerevisiae conferring capacity of xylose metabolism. In the orbital shaker assays the YRH 396 strain showed better fermentation parameters (Yp/s and QP) and had its metabolism studied in a bioreactor, showing an Yp/s of 0.39 g g-1 in the fermentation of the concentrated enzymatic hydrolysate and consumption of 71.2 % of xylose in the fermentation of the acid hydrolysate under anaerobiosis, with Yp/s of 0.33 gg-1. In the fermentation of the acid hydrolysate in an aerated bioreactor with 1 vvm, 64.3% of xylose was consumed with production of 2.9 g L -1 of ethanol and 8.17 g L -1 of xylitol. In the third stage of the work, the species Spathaspora girioi and Spathaspora hagerdaliae were tested fermenting the acid hydrolysate in anaerobiosis and limited oxygen in orbital shaker. Fermentation by the Spathaspora hagerdaliae was staged in a bioreactor and presented Yp/s (ethanol) of 0.32 gg-1 under anaerobiosis and Yx/x (xylitol) of 0.31 under microaerobiosis.