HSP70 extracelular interage com o receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE) e ativa resposta pró-inflamatória em linhagem celular derivada de câncer de pulmão humano (A549)

Abstract

A proteína de choque térmico de 70 kD (HSP70) foi bem caracterizada como uma chaperona molecular intracelular. Recentemente, novas funções extracelulares foram descritas para esta proteína, em que a HSP70 é secretada ativamente em condições inflamatórias. Atuando como DAMPs, a HSP70 extracelular (eHSP70) interage com receptores de membrana, como TLRs, e ativa vias inflamatórias. O RAGE, por sua vez, é um receptor de reconhecimento de padrões e possui expressão aumentada em várias doenças relacionadas a um estado pró-inflamatório crônico. Uma das principais consequências da ligação de um agonista ao RAGE é a ativação dependente de ERK1/2 de NF-kB, que leva à expressão de TNF-α e outras citocinas. Neste contexto, o RAGE surge como candidato a interagir com eHSP70 e modular respostas celulares. O objetivo deste trabalho é elucidar se a eHSP70 é capaz de evocar sinalização dependente de RAGE utilizando células de câncer de pulmão humano A549, as quais expressam constitutivamente RAGE. A interação física entre eHSP70 e RAGE foi confirmada por imunoprecipitação. O tratamento com eHSP70 causou a fosforilação de ERK1/2, p38 e JNK, e o silenciamento de RAGE inibiu apenas a ativação de ERK1/2. Além disso, a transativação de NF-κB relacionada a presença de eHSP70 foi prejudicada pela diminuição dos níveis de RAGE, assim como a expressão de citocinas pró-inflamatórias (TNF-a, IL-1β e IL-6) também estimuladas por eHSP70. Finalmente, o meio condicionado de células A549 tratadas com eHSP70 causou efeitos diferenciais na expressão de citocinas de monócitos U937 quando a expressão de RAGE em A549 é inibida. Juntos, os nossos resultados descrevem a eHSP70 como um possível agonista RAGE capaz de influenciar a interação entre o câncer e as células do sistema imunológico.

Heat shock protein 70 (HSP70) has been well characterized as an intracellular molecular chaperone. Recently, novel extracellular actions have been described for this protein, where HSP70 is actively released in inflammatory conditions. Acting as DAMPs, extracellular HSP70 (eHSP70) interacts with membrane receptors, like TLRs, and activates inflammatory pathways. The receptor for advanced glycation end products (RAGE), in turn, is a pattern-recognition receptor and its expression is increased in several diseases related to a chronic pro-inflammatory state. One of the main consequences of RAGE ligand-binding is the ERK1/2-dependent activation of NF-kB, which leads to expression of TNF-α and other cytokines. At this context, RAGE emerges as a candidate for interaction with eHSP70 and modulate cellular responses. The purpose of this work is to elucidate if eHSP70 is able to evoke RAGE-dependent signaling using A549 human lung cancer cells, which constitutively express RAGE. Physical interaction between eHSP70 and RAGE was confirmed by immunoprecipitation. Treatment with eHSP70 caused ERK1/2, p38 and JNK phosphorylation, and RAGE knockdown inhibited only ERK1/2 activation. Moreover, eHSP70-evoked NF-κB transactivation was impaired by RAGE knockdown. Also, the stimulation of pro-inflammatory cytokines expression (TNF-α, IL-1β and IL-6) by eHSP70 was inhibited in RAGE-silenced cells. Finally, conditioned medium of eHSP70-treated A549 cells caused differential effects in U937 monocytes cytokine expression when A549 RAGE expression is inhibited. Together, our results evidence eHSP70 as a novel RAGE agonist capable of influence the cross-talk between cancer and immune system cells.