Perfil bioquímico e molecular das ectonucleotidases no sistema cardiovascular de ratos diabéticos por estreptozotocina

Abstract

Ectonucleotidases constituem uma cascata enzimática altamente organizada para regulação da sinalização mediada por nucleotídeos, controlando a quantidade e a taxa de degradação destes, além da formação do respectivo nucleosídeo. Nucleotídeos/ nucleosídeos extracelulares são conhecidos por regularem diversas respostas fisiológicas, incluindo o tônus vascular, função cardíaca e homeostasia. Neste estudo nós analisamos a presença dos membros das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5'-nucleotidase em tecido de ventrículo esquerdo (VE) de ratos. A análise por PCR mostrou a expressão da NTPDase1, 2, 3,5,6, ecto-5'-NT/CD73, NPP2 e NPP3, excluindo a presença da NPP1 e NTPDase8. Através da análise por PCR em tempo real, encontramos o maior nível de expressão de mRNA para a NTPDase2 no ventrículo esquerdo. Também caracterizamos as propriedades bioquímicas e atividades enzimáticas em sinaptossomas de terminal nervoso (sinaptossoma cardíaco) em VE. No estudo das propriedades das E-NTPDases e ecto-5'-NT, observamos dependência de cátions divalentes, pH ótimo de 8.0 para as hidrólises de ATP e ADP e 9.5 para a hidrólise de AMP. Os valores de Km aparente são 40 µM, 90 µM, 39 µM e os valores de Vmax aparente são 537, 219 and 111 nmol Pi liberado/min/mg de proteína para as hidrólises de ATP, ADP e AMP, respectivamente. Oligomicina e azida, ambos inibidores de ATPases mitocondriais, inibiram somente a hidrólise de ATP. A hidrólise de AMP não foi afetada por levamisole e tetramisole, enquanto molibdato de amônio praticamente aboliu a atividade da ecto-5'-nucleotidase. Utilizando o p-nitrofenil-5'-timidina monofosfato (p-Nph-5'-TMP) como substrato marcador para E-NPPs na preparação de sinaptossoma cardíaco, observamos um pH alcalino, dependência de cátions divalentes e valores de Km de 91.42 ± 13.97 µM e Vmax calculado de 63.79 ± 3.59 nmol p-nitrofenol liberado/min/mg de proteína. Não houve alteração na hidrólise do substrato com adição de levamisole no pH de 8.9 (pH ótimo caracterizado), porém o suramin reduziu fortemente a hidrólise de p-Nph-5'-TMP. Para estudarmos se estas enzimas poderiam participar na patofisiologia das doenças diabéticas cardiovasculares, usamos um modelo de diabetes experimental por estreptozotocina (STZ) 65mg/kg. A injeção de STZ causou aumento da glicemia, perda de peso corporal, diminuição dos batimentos cardíacos e pressão sangüínea. Seis dias de tratamento com insulina foram capazes de reverter as alterações encontradas no diabetes. Houve uma inibição das hidrólises de ATP e ADP, mas não de AMP e p-Nph-5'-TMP em sinaptossoma cardíaco. O tratamento com insulina reverteu as hidrólises para os níveis do controle (citrato). A análise do metabolismo extracelular de ATP em sinaptossoma cardíaco por HPLC mostrou que o ATP é hidrolisado mais lentamente no grupo diabético. Dados preliminares de análise molecular sugerem a participação das NTPDases 1 e 2 nas hidrólises de nucleotídeos em sinaptossoma cardíaco. Com o intuito de analisar um material biológico de fácil obtenção, avaliamos as atividades das ectonucleotidases e o perfil extracelular de hidrólise de ATP em soro de ratos diabéticos e também a influência da glicemia nestas atividades. Trinta dias após a injeção de STZ, observamos um aumento nas hidrólises de ATP, ADP, AMP e p-Nph-5'-TMP, quando comparados ao grupo citrato e este aumento foi revertido com 6 dias de tratamento com insulina. Glicose (20 mM), in vitro, não afetou a atividade enzimática em soro de ratos controle, após 24 h de pré-incubação. A análise por HPLC mostrou uma rápida hidrólise de ATP em soro de animais diabéticos, diminuindo os níveis de ATP e ADP mais rapidamente do que os grupos controle e insulina. Mostramos uma alteração na hidrólise de nucleotídeos em sinaptossoma cardíaco e em soro de ratos diabéticos. A alteração encontrada em coração parece fazer parte da etiologia da doença cardiovascular diabética. No entando, a alteração encontrada no soro dos ratos diabéticos, diminuição de ADP (pró-agregante plaquetário) e aumento de adenosina (antiagregante plaquetário) parece participar de um sistema de proteção a possíveis danos vasculares decorrentes do diabetes.

Ectonucleotidases constitute a highly organized enzymatic cascade in the regulation of nucleotidemediated signaling, controlling the rate, amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation. Extracellular nucleotides/nucleosides are known to regulate several physiological responses, including vascular tone, cardiac function and haemostasis. In this study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family members, ecto-5'-nucleotidase/CD73 and E-NPPs in rat heart left ventricle. RT-PCR analysis from left ventricle tissue demonstrated different levels of expression of NTPDase1, 2, 3, 5, 6, 5'-NT/CD73, NPP2 and NPP3, but excluded the presence of NPP1 and NTPDase8. By quantitative real-time PCR we identified the NTPDase2 as the enzyme with the highest mRNA expression in rat left ventricle. Moreover, we characterized the biochemical properties and enzyme activities from synaptosomes of the nerve terminal endings (cardiac synaptosomes) of heart left ventricle. In the E-NTPDases study, we observed divalent cation-dependent enzymes that presented optimum pH of 8.0 for ATP and ADP hydrolysis, and 9.5 for AMP hydrolysis. The apparent Km values are 40 µM, 90 µM and 39 µM and apparent Vmax values are 537, 219 and 111 nmol Pi released/min/mg of protein for ATP, ADP and AMP hydrolysis, respectively. Oligomycin and sodium azide, both mitochondrial ATPase inhibitors, inhibited only the ATP hydrolysis. AMP hydrolysis was not affected by levamisole and tetramisole, whereas ammonium molybdate practically abolished the ecto-5'-nucleotidase activity. Using p-nitrophenyl-5'- thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) as substrate for E-NPPs in rat cardiac synaptosomes, we observed an alkaline pH dependence, divalent cation dependence and the Km value corresponded to 91.42 ± 13.97 μM and Vmax value calculated was 63,79 ± 3,59 nmol p-nitrophenol released/min/mg of protein. Levamisole was ineffective as inhibitor of p-Nph-5'-TMP hydrolysis in pH 8.9 (optimum pH for the enzyme characterized). Suramin strongly reduced the hydrolysis of p- Nph-5'-TMP. In order to study if these enzymes could participate in the pathophysiology of diabetic cardiovascular diseases, we induced experimental diabetes with an injection of streptozotocin 65mg/kg to study diabetic complications. The STZ injection caused a rise in glucose levels, loss of body weight, lower heart rate (HR) and systolic blood pressure (SBP) when compared to citrate group (control). The 6 days insulin treatment was able to reverse these parameters. There was an inhibition in ATP and ADP, but not in AMP and p-Nph-5'-TMP hydrolysis in cardiac synaptosomes and the insulin treatment returned the hydrolysis to the citrate group levels. The analysis of extracellular ATP metabolism in cardiac synaptosomes by HPLC shows that ATP was hydrolyzed slower in diabetes group. Preliminar data from molecular analysis suggest the participação of NTPDases 1 and 2 on nucleotide hydrolysis in cardiac synaptosomes. In order to analyse a readily available biological material, we evaluated the ectonucleotidases activities and the profile of extracellular ATP metabolism in blood serum of streptozotocin-diabetic rats and the influence of glycemic status. The 30 days of STZ injection was associated with a raise in ATP, ADP, AMP, and 5'-TMP hydrolysis in blood serum, when compared to the citrate group. In vitro, 20 mM glucose added did not affect ectonucleotidases activities in normal blood serum of rats with 24 h of preincubation. HPLC analysis showed a rapid hydrolysis of extracellular ATP by diabetic animals, decreasing the ATP and ADP levels faster than in serum of control and insulin groups, leading to the formation of high levels of adenosine when compared with citrate and insulin groups. We showed alterations in the nucleotides hydrolysis in the cardiac synaptosomes and in serum from diabetic rats. The cardiac alteration seems to be related to the ethiology of cardiac problems. However, the serum hydrolysis alterations seems to be related to a vascular protection, with the diminution of ADP (pro-agregant) and an increase in adenosine (antiagregant), found in diabetic serum rats.