Busca por potenciais biomarcadores e alvos terapêuticos em tumores cerebrais : papel dos receptores metabotrópicos de glutamato

Abstract

O glioblastoma (GBM) é o mais comum dos tumores primários malignos que afetam o Sistema Nervoso Central (SNC), sendo um dos cânceres mais letais. A ressecção cirúrgica desse tumor é o tratamento de intervenção inicial mais utilizado nos pacientes. Embora a radioterapia e a quimioterapia aumente a sobrevida, a maioria dos pacientes chega ao óbito em até um ano após o diagnóstico. Além disso, os GBM estão entre os tumores mais resistentes à radiação e à quimioterapia. Dessa forma, torna-se imprescindível a busca de novas estratégias terapêuticas que visem à melhora da qualidade de vida dos pacientes e ao aumento do tempo de sobrevida. O glutamato (L-Glu) é o aminoácido encontrado em maior concentração no SNC e ele exerce seus papéis fisiológicos e patológicos através da ativação de receptores de membrana metabotrópicos e ionotrópicos. Diversos estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que células de GBM liberam altos níveis de L-Glu para o meio extracelular, o que promove a sua proliferação e migração, contribuindo para a malignidade deste tipo de tumor. De fato, é provável que a ligação desse aminoácido aos receptores metabotrópicos de glutamato (mGluR) relacione-se com a agressividade dos GBM, visto que eles são amplamente expressos nestas células. Dessa forma, o objetivo desta tese foi investigar o papel dos mGluR sobre a agressividade de GBM, buscando uma assinatura gênica que tenha valor como potencial biomarcador prognóstico e preditivo de tratamento complementar adjuvante. Através da uma meta-análise de duas coortes de amostras de GBM humanos foi possível identificar uma assinatura gênica de mGluR com valor prognóstico, na qual biópsias com alta expressão gênica de mGluR3 e baixa de mGluR4 e mGluR6 predizem um desfecho antecipado para os pacientes. O potencial desses receptores sobre a malignidade desses tumores foi avaliado por experimentos in vitro utilizando o tratamento de linhagens de GBM com ligantes de mGluR. O bloqueio farmacológico de mGluR do grupo II pelo antagonista LY341495 e a ativação farmacológica de mGluR III por L-AP4 diminuíram a porcentagem de células de linhagem de GBM em 25-28 %. A combinação desses tratamentos não apresentou efeito sinérgico. O potencial da assinatura gênica também foi avaliado in vivo utilizando ratos implantados ortotopicamente com células da linhagem C6 e tratados intracisternalmente com os ligantes de mGluR e intraperitonealmente com quimioterápico padrão, a temozolamida. Os resultados obtidos nos experimentos in vivo, apesar de preliminares, em relação ao tratamento com os ligantes de mGluR, são muito promissores, permitindo várias perspectivas em relação a adaptações de protocolo e a realização de experimentos complementares. Este estudo demonstrou que a avaliação da expressão gênica de mGluR3, 4 e 6 em biópsias de GBM humanos possui um grande potencial prognóstico. A diminuição do número de células da linhagem C6 após o tratamento in vitro com ligantes de mGluR (LY341495 e L-AP4) está de acordo com o comportamento de agressividade previsto nos estudos in silico. Embora mais experimentos in vitro e in vivo sejam necessários para melhor avaliação do potencial dessa assinatura gênica de mGluR, os resultados obtidos indicam que a avaliação da expressão dos oito subtipos de mGluR em biópsias de GBM pode ser considerada em âmbito clínico para guiar futuras intervenções quimioterápicas.

Glioblastoma (GBM) is the most common malignant primary tumor of Central Nervous System (CNS) and one of the most lethal cancers. Surgical resection of this tumor is the most commonly initial intervention treatment used in patients. Although radiotherapy and chemotherapy increase survival, it is expected that the majority of patients will die within a year after diagnosis. In addition, GBM are among the most radiation- and chemotherapy-resistant tumors. Thus, it is imperative to search for new therapeutic strategies that aim to improve patients' quality of life and to increase survival time. Glutamate (L-Glu) is the amino acid found in higher concentration in CNS and it exerts its physiological and pathological roles through the activation of metabotropic and ionotropic membrane receptors. Several studies have demonstrated in vitro and in vivo that GBM cells release high levels of L-Glu into extracellular medium. This event was shown to promote GBM proliferation and migration, contributing to the malignancy of this type of tumor. Indeed, it is likely that the binding of that amino acid to metabotropic glutamate receptors (mGluR) relates to GBM aggressiveness, since they are widely expressed in these cells. Thus, the objective of this work was to investigate the role of mGluR on GBM aggressiveness, searching for a gene signature that has potential value as biomarker to predict the prognosis and adjuvant complementary treatment. Through the meta-analysis of two GBM human samples cohorts, it was possible to identify an mGluR gene signature with prognostic value, in which biopsies with high mGluR3 and low mGluR4 and mGluR6 gene expression predict an early outcome for patients. The potential of these receptors on the malignancy of these tumors was assessed by in vitro experiments through the treatment of GBM lineages with mGluR ligands. Pharmacological blockade of group II mGluR by LY341495 and pharmacological activation of group III mGluR by L-AP4 decreased the amount of C6 cells in 25-28 %. The combination of these treatments had no synergistic effect. The potential of the gene signature was also assessed in vitro using GBM-implanted rats treated intracisternally with mGluR ligands and intraperitoneally with standard chemotherapy, temozolomide. The results obtained in in vivo experiments, although very preliminary in relation to treatment with the mGluR ligands, are very promising, allowing several perspectives regarding protocol adaptations and the accomplishment of complementary experiments. This study demonstrated that evaluation of mRNA levels of mGluR3, 4, and 6 in human GBM biopsies has a great prognostic potential. The decrease in number of C6 cells after in vitro treatment with mGluR ligands (LY341495 and L-AP4) is in accordance with the predicted aggressiveness behavior proposed in silico. Although further in vitro and in vivo experiments are required for better evaluation of mGluR gene signature potential, these results indicate that evaluation of the eight mGluR subtypes in GBM biopsies may be considered in clinical scope to guide future chemotherapeutic interventions.