Padronização do uso da técnica de citometria de fluxo para avaliação de morte celular em cultura organotípica de hipocampo de ratos

Abstract

O hipocampo é uma região do cérebro muito estudada por seu envolvimento nos mecanismos de formação de memória e aprendizado, mas principalmente pela incessante investigação dos mecanismos que provocam danos hipocampais que comprometem a função e integridade de neurônios. Doenças neurodegenerativas tais como, Alzheimer, Parkinson ou Isquemia Cerebral, envolvem diferentes tipos de morte celular. Os aspectos morfológicos e características histológicas da morte célular necrótica diferem dos observados na morte celular apoptótica, sendo essas distinções importantes para a caracterização dos mecanismos envolvidos na patologia de determinada doença. Nos últimos anos tem havido crescente aperfeiçoamento das técnicas para identificação e quantificação de grupos celulares, dentre estas, a citometria de fluxo vem demonstrando ser uma tecnologia rápida e reprodutível através da qual se pode realizar análises refinadas, permitindo a avaliação de muitos parâmetros simultaneamente. O objetivo deste trabalho foi padronizar a utilização dessa metodologia no modelo in vitro de cultura organotípica de hipocampo de ratos, para avaliação do tipo de morte celular. Para isto, utilizamos como indutores de morte celular o glutamato, para morte celular necrótica, e a estaurosporina, para a morte apoptótica. Os resultados mostraram que a metodologia padronizada foi eficiente e permite a distinção entre os diferentes tipos de morte celular induzidos neste modelo experimental. Além disso, confirma o potencial da cultura organotípica como modelo experimental para a análise de morte celular em diferentes desordens que levam ao dano hipocampal. E, sobretudo, valida uma técnica rápida e multiparamétrica eficaz para utilização na avaliação de novos agentes neuroprotetores capazes de retardar ou impedir doenças neurodegenerativas.

The hippocampus is a brain region extensively studied for its involvement in learning and memory formation mechanisms, but principally by the relentless investigation of the mechanisms that cause hippocampal damage that compromises the integrity and function of neurons. Neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disesase, Parkinson's disease or Cerebral Ischemia, involve different types of cell death. The morphological and histological characteristics of necrotic cell death are different from those observed in apoptotic cell death, and these are important distinctions for the characterization of the mechanisms involved in the pathology of a certain disease. In recent years, there has been increasing improvement of techniques for identification and quantification of cell groups, among these, flow cytometry, definitely, has proven to be a rapid and reproducible technology by which refined analyzes can be performed by allowing the use of many parameters simultaneously. The aim of this study was to standardize the use of this methodology in the in vitro model of organotypic culture of rat hippocampus to appraise the type of cell death. For this purpose, we used as cell death-inducing glutamate to necrotic cell death, and staurosporine to apoptotic death. The results showed that the standardized method was efficient, and allows the distinction between different types of cell death induced in this experimental model. Furthermore, it confirms the potential of organotypic culture as an experimental model for the analysis of cell death in different disorders that lead to a hippocampal damage. Mainly, it validates a rapid and multiparametric technique, effective for use in the evaluation of new neuroprotective agents capable of delaying or preventing neurodegenerative diseases.