Efeitos do treinamento físico aeróbico sobre o metabolismo do óxido nítrico e da endotelina-1 e sobre o estresse oxidativo no parênquima pulmonar de ratos com hipertensão arterial pulmonar

Abstract

A Hipertensão Arterial Pulmonar (HAP) é uma patologia grave e incapacitante, caracterizada por modificações bioquímicas, morfofuncionais e estruturais que gera aumento progressivo da resistência vascular pulmonar (RVP), da pressão arterial pulmonar média (PAPm) e alterações no ventrículo direito (VD) que culminam com a insuficiência cardíaca direita (ICD), seguida de óbito. O efeito do exercício físico aeróbio sobre o estresse oxidativo e sobre o metabolismo do óxido nítrico (NO) e endotelina-1 (ET-1), no tecido pulmonar é desconhecido. Assim, este estudo teve como objetivo verificar a influência de um protocolo de exercício físico sobre o estresse oxidativo pulmonar e o seu papel modulador no metabolismo do NO e da ET-1 em ratos com HAP. Para isso, foram utilizados 28 ratos machos Wistar, divididos em quatro grupos experimentais (5-7 animais): CS (controle sedentário), MS (monocrotalina sedentário), CT (controle treinado) e MT (monocrotalina treinado). Os animais dos grupos CT e MT participaram de duas semanas de pré-treinamento em esteira adaptada para ratos. No final desse período, os animais dos grupos MS e MT receberam dose única (60 mg/Kg) intraperitoneal de monocrotalina (MCT), enquanto que os animais dos grupos CS e CT, receberam salina na mesma dose. Em seguida, os animais dos grupos CT e MT foram submetidos a três semanas de treinamento aeróbio, com frequência de cinco vezes por semana e utilização de 60% do VO2 máximo. Análises ecocardiográficas foram realizadas 24 horas após a última sessão de exercício físico aeróbio. Os parâmetros de tempo de aceleração/tempo de ejeção do fluxo pela artéria pulmonar (TAC/TEJ), volume sistólico (VS), débito cardíaco (DC), excursão sistólica do plano do anel da tricúspede (TAPSE), fração de enchimento (FEC), mudança da área fracional (FAC), índice de performance do miocárdio (IPM) e velocidade de enchimento rápido/lento do ventrículo direito (E/A) foram analisados e, em seguida, os ratos foram mortos por sobrecarga anestésica, confirmada por deslocamento cervical. Seus órgãos (coração, fígado e pulmão) foram coletados para realização posterior das análises. A massa do coração foi utilizada para analisar a hipertrofia cardíaca (HC) e a massa do fígado, para analisar a congestão hepática. O lobo direito do pulmão foi separado para realização das análises bioquímicas e moleculares e, o lobo esquerdo para realização das análises imuno-histoquímicas. A administração de MCT promoveu hipertrofia do VD, redução dos parâmetros TAC/TEJ, DC, VS e TAPSE, sendo que o exercício físico aeróbio acentuou essa redução nas análises do TAC/TEJ e DC. Nos demais parâmetros ecocardiográficos e na congestão hepática, não encontramos diferenças significativas entre os grupos experimentais. Nos resultados bioquímicos encontramos aumento da concentração do radical superóxido (O2.-) nos grupos MCT, principalmente no grupo MT, inalteração da concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) e da atividade da enzima NADPH Oxidase (NOX). Em relação às enzimas antioxidantes, encontramos redução da atividade da superóxido dismutase (SOD) nos animais que participaram do protocolo de treinamento físico e inalteração da sua expressão por Western Blot. A catalase (CAT), por sua vez, teve sua atividade reduzida nos animais que receberam MCT e também na sua expressão no grupo MS quando comparado ao CS. Já o grupo MT teve aumento da expressão da CAT quando comparado ao grupo MS.Em relação à atividade da enzima glutationa peroxidase (GPx) houve aumento nos grupos que receberam a MCT, principalmente no grupo MT. Encontramos ainda, redução nos danos oxidativos a proteínas e lipídios nos grupos que receberam MCT. O metabolismo do NO também foi afetado, uma vez que evidenciamos redução da atividade da óxido nítrico sintase (NOS) nos animais que participaram do protocolo de treinamento aeróbio e também naqueles que receberam a MCT. A concentração de nitritos totais e da expressão de enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) não apresentaram diferenças significativas entre os diferentes grupos experimentais. Houve aumento na marcação da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e na nitrotirosina em arteríolas pulmonares dos animais que receberam MCT, sendo mais acentuada nos animais do grupo MT. Ainda, não encontramos alterações significativas na expressão do receptor A (ET-A) da ET-1, mas sim, redução da expressão do receptor B (ET-B). Em conclusão, o modelo experimental de HAP induzido por MCT, foi reproduzido nesse estudo e a realização do protocolo de treinamento físico mostrou-se incapaz de atenuar e/ou reverter as alterações no metabolismo do NO e da ET-1, bem como o aumento do estresse oxidativo causados pela droga, no tecido pulmonar. Na verdade, em muitas análises, foram encontrados efeitos prejudiciais do exercício físico, potencializando a progressão e severidade da doença.

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a serious and disabling condition characterized by biochemical, morphological, functional and structural alterations, which generate a progressive increase in pulmonary vascular resistance (PVR) and in mean pulmonary arterial pressure (mPAP), together with changes in right ventricle (RV). This scenario leads to right heart failure, followed by death. The effects of aerobic exercise on oxidative stress, metabolism of nitric oxide (NO) and endothelin-1 (ET-1) in lung tissue are unknown. This study aimed to verify the influence of a physical exercise protocol on pulmonary oxidative stress and also the modulatory role of exercise in the metabolism of NO and ET-1 in rats with PAH. Then, 28 male Wistar rats were used, divided into four groups (5-7 animals/group): SC (sedentary control), SM (sedentary monocrotaline), TC (trained control), and TM (trained monocrotaline). Animals of TC and TM groups participated in two weeks of pre-training on a treadmill adapted to rats. At the end of this period, the animals of TM and SM groups received a single injection (60 mg/kg, i.p.) of monocrotaline (MCT), whereas animals of SC and TC groups received saline at the same volume. Then, the animals of TC and TM groups underwent three weeks of aerobic training, five times a week, using 60% of maximum VO2. Echocardiographic analysis was performed 24 hours after the last aerobic exercise session. The parameters of acceleration /ejection time of pulmonary artery flow (AT/ET), stroke volume (SV), cardiac output (CO), tricuspid annular plane systolic excursion (TAPSE), filling fraction (FF), fractional area change (FAC), myocardial performance index (MPI) and fast/slow rate of right ventricular filling (E/A ratio) were analyzed, and then rats were euthanized with anesthetic overload, confirmed by cervical dislocation. Heart, liver and lungs were collected to perform later analysis. Heart mass was used to analyze cardiac hypertrophy (CH), and liver mass to analyze hepatic congestion. The right lobe of lung was separated to biochemical and molecular measurements and the left lobe to perform immunohistochemical analysis. The administration of MCT promoted RV hypertrophy, and reduced AT/ET, CO, SV, and TAPSE. However, aerobic exercised groups had an accentuated reduction in the analysis of the AT/ET and CO. We found no significant differences between the experimental groups in other echocardiographic parameters and liver congestion analysis. Biochemical results showed increased concentrations of superoxide radical (O2.-) in the MCT group, especially in the TM group, with no changes in hydrogen peroxide concentration (H2O2) and NADPH oxidase enzyme activity (NOX). Regarding the antioxidant enzymes, we found reduced activity of superoxide dismutase (SOD) in animals that underwent physical training protocol, with no changes in expression by Western blot. Catalase (CAT), in turn, reduced its activity in animals that received MCT and in its expression in the SM group, when compared to SC. However, animals in TM group had increased expression of CAT when compared to SM group. Regarding the activity of glutathione peroxidase enzyme (GPx) there was an increase in the groups that received MCT, mainly in the TM group. The groups that received MCT presented reduction in oxidative damage to proteins and lipids. NO metabolism was also affected, once reduction in the activity of nitric oxide synthase (NOS) was observed in animals that participated in the aerobic training protocol and also in those who received MCT. The concentration of total nitrites and the endothelial nitric oxide synthase enzyme (eNOS) expression showed no significant differences between the different experimental groups. There was an increase in the immunohistochemical analysis of the inducible nitric oxide synthase enzyme (iNOS) and nitrotyrosine in pulmonary arterioles of animals that received MCT, being more pronounced in the animals of TM group. Although no significant changes in the A receptor of ET-1 (ET-A) expression were identified, it was detected a decrease in the B receptor of ET-1 (ETB) expression. In conclusion, the experimental model of PAH induced by MCT was reproduced in this study and physical training protocol execution proved to be unable to mitigate and/or reverse changes in the metabolism of NO and ET-1, as well as the increased oxidative stress caused by the drug in lung tissue. In fact, in many analyzes, harmful effects of exercise were found, contributing to progression and severity of the disease.