Envolvimento do peptídeo liberador da gastrina, de seu receptor e da via PI3K/AKT na fisiopatologia da artrite : um estudo in vitro em fibroblastos sinoviais

Abstract

Introdução: A artrite reumatoide é caracterizada pela invasão de fibroblastos sinoviais no interior da cartilagem e pela erosão do osso ocasionando uma progressiva destruição da articulação. A invasão de fibroblastos in vitro é correlacionada com o dano articular na AR, entretanto pouco é sabido sobre esta regulação. O peptídeo liberador da gastrina (GRP) é um homólogo funcional da bombesina e sua sinalização através de seu receptor está envolvida em diversas funções, incluindo a resposta inflamatória. O GRP e seu receptor (GRPR) têm sido encontrados na membrana sinovial e no fluído de pacientes com AR, mas o envolvimento dos mesmos na AR não está completamente elucidado. Em paralelo, estudos tem mostrado que a sinalização GRP/GRPR está relacionada com a sinalização PI3K/AKT. Esta última, é uma via de sinalização que apresenta um papel chave em diversos processos celulares, como proliferação, migração e invasão celular. O RC-3095 é um antagonista do GRPR. Objetivo: Avaliar o envolvimento do GRP e do GRPR no comportamento invasivo dos FLS de camundongo com artrite, bem como o envolvimento do GRP na sinalização da via PI3K/AKT. Métodos: FLS foram isolados das articulações de camundongos com artrite induzida por colágeno. A expressão de GRPR foi investigada por imunocitoquímica e por western blot. A proliferação celular foi avaliada pelo ensaio de sulforodamina B após o tratamento dos FLS com GRP e/ou RC-3095 (antagonista do GRP), e/ou Ly294002 (inibidor da via PI3K/AKT) e a capacidade invasora dessas células após o tratamento com GRP, RC-3095 ou Ly249002 foi avaliada utilizando um ensaio de invasão em matrigel. A fosforilação da AKT foi analisada através de western blot. Resultados: A proteína GRPR foi detectada por imunocitoquímica e western blot. A exposição ao GRP aumentou cerca de duas vezes a invasão comparado com células não tratadas (p<0,05), enquanto que o RC-3095 reverteu este efeito (p<0,001). O GRP também aumentou a expressão de AKT fosforilada. Por fim, quando adicionado Ly294002 com GRP, o mesmo preveniu o aumento da invasão induzida por GRP (p<0.001). Conclusão: Esta é a primeira vez que a expressão de GRPR está sendo demonstrado nos FLS. Além disso, este trabalho sugere que o GRP aumenta o comportamento invasor dos FLS. Este efeito ocorre em parte através da ativação da AKT. Entretanto, mais estudos devem ser realizados sobre a via GRP/GRPR, já que a mesma pode ser relevante para o desenvolvimento de terapias cujo alvo são os FLS.

Introduction: Rheumatoid Arthritis (RA) is characterized by invasion of fibroblast-like synoviocytes (FLS) into de articular cartilage and by bone erosion leading to progressive joint destruction. FLS in vitro invasiveness correlates with articular damage in RA, yet little is known about this regulation. Gastrin-releasing peptide (GRP) is a functional homologue of bombesin, and its receptor signaling is involved in several functions, including the inflammatory response. GRP and its receptor (GRPR) have been found in synovial membrane and fluid of RA patient, but their involvement with RA is not completely elucidated. In parallel, studies have shown that GRP/GRPR is related with PI3K/AKT signaling. This pathway plays a key role in multiple cellular processes such as cell proliferation, migration and invasion. RC-3095 is an antagonist of GRPR. Objective: To examine the role of gastrin-releasing peptide (GRP) and its receptor (GRPR) on the invasive behavior of fibroblast-like synoviocytes (FLS) from arthritic mice, as well as to evaluate GRP-induced signaling on PI3K/AKT pathway. Methods: FLS were isolated from the joints of mice with collagen-induced arthritis (CIA). Expression of GRPR in FLS was investigated by immunocytochemistry and western blot (WB). FLS treated with GRP and/or RC-3095 (GRP antagonist), and/or Ly294002 (inhibitor of PI3K/AKT pathway) were assessed for proliferation by sulforhodamine B assay over a three-day period, and for invasion using a Matrigel-coated transwell system over 24 hours. Akt phosphorylation was assessed by WB. Results: GRPR protein was detected in FLS by immunocytochemistry and WB. Exposure to GRP increased FLS invasion by nearly two-fold, compared with untreated cells (p<0.05), while RC-3095 reversed that effect (p<0.001). GRP also increased phosphorylated AKT expression in FLS. When Ly294002 was added with GRP, it prevented the GRP-induced increased cell invasiveness (p<0.001). Conclusion: GRPR was expressed on FLS and mediates the GRP-induced increased invasiveness. This effect occurs at least in part through the AKT activation. Further understanding of the GRP/GRPR pathway could be relevant in the development of FLS-targeted therapy for RA.