Análise funcional de quatro genes putativos da família GH18 de glicosil hidrolases no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae

Abstract

Metarhizium anisopliae é um fungo filamentoso entomopatogênico, da ordem Hypocreales, que infecta um grande número de espécies de artrópodes. Este fungo caracteriza-se por ser um dos primeiros organismos a ser aplicado em larga escala para o controle de insetos-praga na Agricultura. A penetração através da carapaça do hospedeiro constitui sua via preferencial de infecção, sendo esta a primeira barreira a ser superada. Com composições variáveis, na maioria dos artrópodes a carapaça é, geralmente, rica em quitina. A quitina é um polissacarídeo composto por monômeros de N-acetilglicosamina (GlcNAc) que também está presente na parede celular de fungos filamentosos. Para transpassar essa barreira, o fungo combina diferentes estratégias, como pressão mecânica e a dissolução da cutícula pela secreção de diversas enzimas hidrolíticas. Dentre as enzimas secretadas estão as quitinases, responsáveis por catalisar a hidrólise de ligações glicosídicas β-1,4 entre monômeros GlcNAc. Em fungos, as quitinases não apresentam apenas importância nutricional, participando ativamente de processos morfogênicos e autolíticos. Quitinases e endo-β-D-N-acetilglicosaminidases (ENGases) são membros da família GH18 de glicosil hidrolases em fungos filamentosos As ENGases catalisam uma reação de hidrólise semelhante à das quitinases, porém utilizando N-oligossacarídeos como substrato, em detrimento a quitina, em uma reação de deglicosilação. Uma análise genômica realizada em nosso laboratório, na linhagem E6 de M. anisopliae, identificou vinte e quatro genes putativos contendo o domínio GH18, os quais foram classificados em cinco subgrupos, baseado em similaridade de sequências, relações filogenéticas, presença de domínios e características funcionais. Com nove genes agrupados no subgrupo A, sete genes no B, quatro genes no C, um gene no subgrupo D e três genes em um subgrupo contendo ENGases. A importância do gene do subgrupo D (chimaD1) e dos genes do subgrupo das ENGases (MaEng18A, MaEng18B e MaEng18C), permanece ainda desconhecida em M. anisopliae. O presente estudo visou avaliar, pela construção de mutantes funcionais, a importância destes genes no ciclo de vida do fungo Análises filogenéticas foram conduzidas, levantando hipóteses sobre a evolução do gene ChimaD1, e das ENGases de fungos. Diferindo de outros fungos filamentos analisados, que possuem apenas uma ENGase putativa secretada e outra cópia com possível atividade citosólica, M. anisopliae possui dois possíveis parálogos com peptídeo sinal predito. A presença destes dois genes pode estar correlacionada ao estilo de vida de do fungo. Um mutante nulo para o gene chimaD1 foi construído, e construções de mutantes nulos para os demais genes estão em andamento. Futuras análises fenotípicas destes mutantes devem auxiliar na compreensão de diversos aspectos do ciclo de vida e da importância da família GH18 em fungos.

Metarhizium anisopliae is an entomopathogenic fungus of Hypocreales order that infects a huge range of arthropod species worldwide, being one of the first organisms widely applied to control crop pests. The fungal penetration through host cuticle constitutes the preferential route to establish M. anisopliae infection, and it is the first barrier to be surpassed to obtain a successful infection. Exhibiting a variable composition, the cuticle is a chitin-rich structure in many arthropods. The chitin, an N-acetylglucosamine (GlcNAc) polysaccharide is also found in filamentous fungi cell wall. In order to surpass the host cuticle barrier, the fungus combines different strategies, such as mechanical pressure and secretion of several hydrolytic enzymes. Among these secreted enzymes there are chitinases. These enzymes are responsible for catalyze the hydrolysis of β-1,4 glycosidic bonds between GlcNAc monomers. In fungi, chitinases presents not only nutritional importance, but also exhibit morphogenic and autolytic functions, acting at different processes of fungal development and life cycle maintenance. In filamentous fungi glycoside hydrolase family 18 (GH18) contains enzymes with chitinase and endo-β-D-N-acetylglucosaminidases (ENGases) activity. The ENGases are similar to chitinases, catalyzing a similar hydrolysis reaction but using N-oligosaccharides as substrate instead of chitin, in a deglycosylation A genomic analysis performed in our laboratory, in M. anisopliae E6 strain, identified twenty-four putative genes containing the GH18 domain, which were classified five subgroups. Nine genes were assigned to subgroup A, seven genes to B, four to C, one gene to D and three genes to a subgroup containing only ENGases. This classification was based on sequence similarity, domains organization, phylogenetic relationship and functional features. The importance of subgroup D gene (chimaD1) and the genes from ENGase subgroup (MaEng18A, MaEng18B and MaEng18C) remains unknown in M. anisopliae. The present study aims to evaluate, through the construction of knockout mutants, the function of these genes in the fungus life cycle. Differing from other filamentous fungi analyzed, which have two ENGases, one putatively secreted and other with possible cytosolic activity, M. anisopliae has two putative secreted ENGases. This difference could be related with fungus life style. Phylogenetic analyses were conducted, raising hypotheses about chimaD1 and fungal ENGases evolution. A ChimaD1 knockout strain has been created, as well as knockout strains for the others genes are in progress. Future phenotypic analysis of these knockout strains could help explaining some aspects from fungi life cycle and the importance of GH18 family.