Construção de mutante de superexpressão para avaliação funcional do gene CNBG4278 de Cryptococcus gattii

Abstract

As leveduras encapsuladas Cryptococcus gattii e Cryptococcus neoformans são os principais agentes etiológicos da criptococose. Estimativas apontam um milhão de casos anuais de infecção por Cryptococcus no mundo, gerando 620 mil mortes anualmente1. A infeccão é causada principalmente por C. neoformans, atingindo preferencialmente pacientes imunocomprometidos. No entanto, também há incidência marcante em pacientes imunocompetentes, principalmente pela infecção de C. gattii2. A infecção por Cryptococcus sp. se inicia a partir da inalação de esporos ou leveduras dessecadas presentes no ambiente3. Árvores de eucalipto (Eucalyptus calmadulensis) e madeiras em decomposição são as principais fontes ambientais de C. gattii, enquanto que C. neoformans está geralmente associado ao solo e excretas de aves, principalmente pombos (Columba livia)4. Após a deposição das células fúngicas no pulmão, ocorre a interação com os macrófagos alveolares, sendo este o primeiro contato com o sistema imune do hospedeiro5. Estas células se depositam inicialmente nos alvéolos pulmonares, podendo ocorrer subsequente disseminação para o Sistema Nervoso Central (SNC)3. Estima-se que C. gattii e C. neoformans divergiram de um ancestral comum há 18,5 e 37 milhões de anos, respectivamente3. A espécie C. gattii pode ser subdividida nos sorotipos B e C, possuindo quatro tipos moleculares: VGI, VGII, VGIII e VGIV, sendo os dois primeiros associados à infecção em indivíduos saudáveis. Primeiramente, acreditava-se que a ocorrência de C. gattii era limitada às regiões tropicais e subtropicais, como Austrália, Nova Zelândia e sudeste da Ásia 6. Porém, este panorama mudou após o surto de infecção por C. gattii na ilha de Vancouver, Canadá, no ano de 1999, admitindo-se também a existência do fungo em regiões temperadas 6. Ao longo da evolução, as leveduras C. neoformans e C. gattii desenvolveram mecanismos que, quando expressos, auxiliam no sucesso da infecção, dependendo também da suscetibilidade de seu hospedeiro. Estes mecanismos são conhecidos como fatores de virulência. Tanto C. gattii quanto C. neoformans possuem fatores de virulência bem estabelecidos, como a capacidade de crescimento a 37 °C, produção de uma cápsula polissacarídica e produção de melanina. Além destes três principais fatores, estudos demonstram que as enzimas urease e fosfolipase também contribuem com a virulência de Cryptococcus sp 7. Devido à alta toxicidade dos atuais tratamentos anfitúngicos ao hospedeiro e ao aumento do número de cepas resistentes, estudos que visam gerar inovações na área de imunoterapia para o tratamento da criptococose são de grande relevância. As manoproteínas correspondem a aproximadamente 1% da composição da cápsula de Cryptococcus e são extremamente imunogênicas8. Considerando que estas proteínas são capazes de induzir resposta imune mediada por células T, sua utilização no desenvolvimento de novas terapias contra a criptococose é promissora9. No entanto, ainda não existem relatos da caracterização de manoproteínas de C. gattii. Este fato, aliado ao aumento da expressão do gene CNBG4278, o qual codifica uma manoproteína, em situações de interação com o hospedeiro, sugere que este gene pode ser um interessante alvo de estudo. Sendo assim, este trabalho objetivou construir linhagens de superexpressão deste gene para sua caracterização funcional. Para tanto, foi realizada a construção de mutantes de superexpressão de CNBG4278 em um mutante nulo para este gene. As três linhagens que apresentaram maiores níveis relativos do mRNA do gene de interesse foram selecionadas para a realização dos experimentos posteriores. Foram realizados testes fenotípicos com as linhagens de superexpressão selecionadas, juntamente com os mutantes nulo e complementado, anteriormente construídos por Reuwsaat J.V.C. (dados não publicados). As linhagens estudadas foram submetidas a testes para avaliar a capacidade de crescimento à 37 °C, na presença de estressores osmóticos e iônicos e em condições de estresse a parede celular. Além disso, foi realizada a indução da cápsula polissacarídica e testes para avaliar a atividade de urease e fosfolipase, bem como a secreção de melanina para o sobrenadante.