Desenvolvimento de sistemas de análise da função gênica para fungos entomopatogênicos : construção de linhagem ΔKu70 em Metarhizium anisopliae

Abstract

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é um organismo-modelo para o estudo das interações patógenos-hospedeiros. A caracterização da função gênica pela construção de mutantes nulos é uma das abordagens mais utilizadas para caracterizar a infecção, realizada a partir da interrupção do locus de interesse via recombinação homóloga. No entanto, a geração de mutantes nulos por recombinação homóloga exibe baixa eficiência em fungos filamentosos uma vez que a recombinação não homóloga é a principal via de reparo. Entre as proteínas envolvidas neste processo estão o heterodímero Ku, proteína quinase dependente de DNA e o complexo ligase IV-Xrcc4. Sabe-se que mutantes na via de recombinação não homóloga aumentam a frequência de recombinação homóloga. Portanto, o objetivo deste trabalho é obter mutantes para o gene ku70, a fim de aumentar a taxa de recombinação homóloga para que, posteriormente, possam ser construídos, com maior eficiência, mutantes funcionais para genes alvo em M. anisopliae. Para isso, foi construído um cassette de deleção para o gene ku70, que foi clonado no vetor binário pPZP201BK, construindo o vetor pPZP::ΔKu70::nat. Este vetor foi utilizado na transformação de M. anisopliae mediada por Agrobacterium tumefaciens. Desta transformação, foram obtidos seis mutantes com o locus do gene ku70 interrompido. Estes mutantes foram submetidos a teste de tolerância a estressores abióticos a fim de avaliar se a sensibilidade a estes compostos foi alterada. A taxa de crescimento e morfologia foram similares às da linhagem selvagem. Além disso, para confirmar o aumento da recombinação homóloga, cinco mutantes foram utilizados na construção de um mutante nulo para o gene chimaD1. Esta análise inicial indica que a taxa de recombinação homóloga aumentou de 1 % na linhagem selvagem para aproximadamente 40 % na linhagem Δku70. A eficiência de infecção dos mutantes, avaliada por bioensaio com Ulomoides dermestoides, indicou ausência de diferença entre a linhagem selvagem e a linhagem Δku70.

The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae is a model to study host-pathogen interactions. The characterization of gene function by the construction of null mutants is one of the most used approaches to characterize the infection, and it requires the interruption of the locus of interest by homologous recombination. However, generation of null mutants by homologous recombination exhibits low efficiency in filamentous fungi because non-homologous end joining is the major repair pathway. Among the proteins involved in this process are the heterodimer Ku, the DNA-dependent protein kinase and the LigIV-Xrcc4 complex. It is known that knockout strains of genes responsible for the non-homologous end joining pathway increase the frequency of homologous recombination. Therefore, the present study aims to obtain ku70 knockout strains in order to increase the homologous recombination rate and to develop functional mutants in M. anisopliae more efficiently. Thus, it was constructed a ku70 gene deletion cassette which was cloned into pPZP201BK vector, originating the pPZP::ΔKu70::nat vector. This vector was used in transformation of M. anisopliae mediated by Agrobacterium tumefaciens. As a result, six mutants exhibiting the disrupted ku70 locus were obtained. These mutants were subjected to abiotic stress to evaluate if the sensitivity to some compounds was affected. The growth rate and morphology from the mutants were similar to the wild type strain. Moreover, to confirm the increase of homologous recombination rates, five mutants were analysed by constructing a chimaD1 knockout strain. This initial analysis indicates that homologous recombination increased from 1 % in wild type strain to 40 % in ku70 knockout strain. The infection efficiency evaluated in bioassays with Ulomoides dermestoides indicated no difference between wild type strain and ku70 knockout strain.