Efeito da criopreservação nas características das células-tronco mesenquimais pulpares de dentes decíduos humanos

Abstract

As células-tronco mesenquimais (CTMs) tornaram-se um grande interesse para a ciência por serem capazes de estimular a regeneração tecidual, apresentarem habilidade de se expandir e diferenciar em cultura e, consequentemente, apresentarem diversas possibilidades terapêuticas, bem como para a engenharia de tecidos. Muitos dos tecidos dentários também apresentam nichos de CTMs. O fácil acesso à polpa dos dentes decíduos, em virtude da esfoliação dental, a torna uma fonte muito atraente para a terapêutica e a engenharia de tecidos. Todos os avanços advindos das terapias baseadas em células-tronco tornam a preservação das fontes celulares, por longos períodos de tempo, um assunto de suma importância. Para que isso possa ocorrer, métodos de armazenamento devem ser adotados, tanto para as culturas celulares já estabelecidas, quanto para os tecidos inteiros. Uma das formas mais comuns de manutenção de culturas e de tecidos é a criopreservação em nitrogênio líquido. Contudo, existem poucas evidências no sentido de estabelecer um protocolo eficaz para o congelamento do dente decíduo intacto. Dessa forma, esse trabalho objetivou isolar, cultivar e caracterizar, para parâmetros apresentados para CTMs, as células pulpares após a criopreservação de dentes decíduos intactos por 7 dias. Para isso, vinte e seis dentes decíduos foram alocados em 2 grupos experimentais, sendo: grupo 1, células pulpares de dentes decíduos criopreservados intactos (grupo Crio) e grupo 2, células pulpares de dentes decíduos isoladas imediatamente após a exodontia (grupo fresco - controle). As células pulpares de ambos os grupos foram isoladas, cultivadas, analisadas por citometria de fluxo (CD14, CD29, CD34, CD45, CD73, CD90 e HLA-DR), submetidas aos protocolos de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica, e aos ensaios de proliferação celular (WST-8). A morfologia celular de ambos os grupos foi avaliada por microscopia confocal. Os resultados demonstraram uma taxa de cultivo de 30% para o grupo Crio e 61% para o grupo Fresco. Não houve diferença estatística entre os grupos para os marcadores de superfície analisados. As células de ambos os grupos foram capazes de se diferenciar em células das 3 linhagens testadas. Para o ensaio de proliferação, não houve diferença estatística entre os grupos ao longo dos tempos testados (p>0,05), embora a média de dias entre o isolamento e a quinta passagem foi menor para o grupo controle (p=0,035). As células do grupo Crio mostraram morfologia alterada. Assim, conclui-se ser possível obter células-tronco da polpa de dentes decíduos congelados pelo protocolo sugerido, sem alterações imunofenotípicas. No entanto, esse protocolo demonstrou baixas taxas de sucesso de isolamento, menor capacidade de diferenciação e de proliferação, além de alteração da morfologia celular.

Mesenchymal stem cells (MSC) became of great value for science for being capable of stimulating tissue regeneration and showing ability to proliferate and differentiate when cultured properly. Dental tissues also present MSC niches as well. Mesenchymal stem cells from the pulp of deciduous teeth are considered an easy access source during a specific period of time in the patients life, when teeth are undergoing exfoliation; therefore, very attractive for cell based therapeutics and tissue engineering. All advances seen in cell based therapies for the last years depend on cell or tissue preservation for long periods of time. Thus, storage methods must be adopted for cultures of cells and whole tissues. The most common technique to preserve cell cultures and tissues is cryopreservation with liquid nitrogen. However, fragile evidence concerns the cryopreservation of intact deciduous teeth. This research aimed to isolate, cultivate and characterize the dental pulp cells of intact cryopreserved deciduous teeth and compare to the dental pulp cells of non-cryopreserved deciduous teeth. Thirteen pairs of deciduous teeth were donated from patients in orthodontic treatment and were randomly allocated in two different groups. The first group was made of cryopreserved intact deciduous teeth (Cryo group), and in second group pulp cells were isolated from fresh teeth (Fresh group). The cells of both groups were isolated, cultivated and characterized for mesenchymal stem cell parameters, and then compared for isolation and proliferation rates, surface markers expression (CD14, CD29, CD34, CD45, CD73, CD90 and HLA-DR), differentiation ability and morphology. The culture rate was 30% for the cryopreserved group and 61% for the fresh. There were no statistical differences between the groups for the surface markers tested. Cells in both groups were capable of differentiating in the 3 mesenchymal lineages. For the proliferation assay, there was no statistical difference between groups throughout the time tested although the mean time between isolation and the fifth passage was lower for the control group (p=0,035). Cells from Cryo group showed altered morphology. The present study showed that Dental Pulp Stem Cells can be obtained from cryopreserved intact deciduous teeth without changes in the immunophenotypical profile, however low success rates for isolation, differentiation ability and morphological alterations were observed.