Avaliação genotípica e fenotípica da enzima diidropirimidina desidrogenase (DPD) e risco de toxicidade com o uso de fluoropirimidinas

Abstract

Base teórica: As fluoropirimidinas possuem significativa variabilidade na resposta terapêutica e na ocorrência de toxicidade, o que tem sido relacionado à deficiência na depuração metabólica mediada pela enzima diidropirimidina desidrogenase (DPD). Mutações nos genes codificadores da enzima, bem como fatores ambientais podem levar à baixa ou nula expressão enzimática, provocando efeitos adversos graves devido ao acúmulo destes fármacos. Até o presente, nenhum teste reconhecidamente valido para a identificação de indivíduos em risco de toxicidade severa está estabelecido na prática oncológica. A genotipagem para o gene DPYD apresenta poder preditivo limitado, pois é capaz de rastrear somente as mutações já conhecidas, que apresentam baixa frequência populacional. Por esta razão, ensaios funcionais baseados na avaliação da redução fisiológica do uracil (U) para diidrouracil (UH2), igualmente medidada pela DPD, têm sido propostos na identificação de pacientes predispostos à toxicidade. Nesta abordagem são estimadas as razões plasmáticas [UH2]/[U] em níveis basais ou após uma dose oral do U. Recentemente, foi sugerida a realização do teste funcional em saliva como amostra alternativa ao plasma, com maior estabilidade dos analitos. Entretanto, a associação entre as razões metabólicas nesta matriz e a toxicidade não foi validada em amostras clínicas. Objetivos: Avaliar a efetividade dos métodos de determinação da razão metabólica [UH2]/[U] em plasma e saliva e a genotipagem para o gene DPYD como preditores de toxicidade por fluoropirimidinas em pacientes com neoplasias gastrointestinais. Adicionalmente, o trabalho propôs o desenvolvimento de um método bioanalítico para a determinação de U e UH2 por cromatografia líquida de alta eficiência. Métodos: Foram obtidas amostras pareadas de plasma e saliva de 60 pacientes diagnosticados com neoplasia gastrointestinal e com indicação de tratamento com fluoropirimidinas. As concentrações de U e UH2 foram determinadas nas duas matrizes através de LC-MS/MS. Os efeitos adversos do primeiro ciclo de quimioterapia foram classificados de acordo com o NCI-CTCAE versão 4. A genotipagem da DYDP foi realizada por PCR tempo real e incluiu os alelos *2A; *13, Y186C; I560S, *7 Y186C. Resultados: 35% dos pacientes apresentaram toxicidade severa (graus 3/4), sendo a neutropenia a mais frequente (n=11). A genotipagem da DYDP não foi capaz de identificar pacientes em risco de toxicidade, uma vez que não foram encontrados portadores de alelos variáveis. As razões [UH2]/[U] variaram amplamente entre os pacientes, de 0,09 a 26,73 no plasma e de 0,08 a 24 na saliva. As razões [UH2]/[U] no plasma e na saliva demonstraram correlação elevada (rs=-0,575; P<0,01), porém, a saliva demonstrou maior correlação com o grau de toxicidade quando comparada ao plasma (rs=-0,515; P<0,01 vs rs=-0,282 P<0,05). Pacientes com grau de toxicidade 3/4 (n=21) apresentaram menor razão metabólica em comparação a pacientes com grau 1/2 (n=26) ou com ausência de toxicidade (n=13) (média 0.59 vs 2.22 e 2.83 no plasma e 1.62 vs 6.88 e 6.75 na saliva, P<0.01). A partir de curva ROC foi determinado o valor de corte de 1,16 para a razão em saliva com 86% de sensibilidade e 77% de especificidade para a identificação de pacientes com toxicidade severa. Nas amostras de plasma o valor de corte foi 4.0 com 71% de sensibilidade e 76% de especificidade. Adicionalmente, foi desenvolvido e validado um método bioanalítico para a dosagem de U e UH2 com exatidão (98.4–105.3%) e precisão precisão intra-ensaio (5.1–12.1%) e inter-ensaios (5.3–10.1%) satisfatórios. Conclusão: Neste grupo de pacientes a genotipagem dos alelos *2A; Y186C; I560S, Y186C e *7 da DPYD não mostrou-se útil na identificação de indivíduos com deficiência severa da DPD. Entretanto, as razões metabólicas [UH2]/[U] demonstraram ser um promissor teste para avaliar a funcionalidade da enzima e identificar a maioria dos casos de pacientes com sujeitos a toxicidade grave à fluoropirimidinas, com sensibilidade superior da saliva.

Background: Variation on therapeutic response to fluoropirimidines and toxicity have been related to impaired dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) mediated metabolism. Mutations in genes encoding the enzyme as well as environmental factors can lead to reduced or absent enzyme expression, causing serious adverse effects due to the accumulation of these drugs. To date, there is no clinically recognized valid assay, for the identification of individuals at risk of severe toxicity in oncological practice. DPYD genotyping has a limited prediction power, since it is able to identify only the already known mutations, which have low frequency in population. Therefore, functional DPD assays based on the assessment of uracil (U) to dihydrouracil (UH2) metabolism, which is also dependent on DPD, have been proposed to identify patients prone to toxicity. Thus, endogenous metabolic ratios of [UH2]/[U] or after an oral dose of U are determined in plasma. Recently, the use of saliva has been suggested as alternative matrix to plasma, with higher stability of analytes. However, the association between salivary metabolic ratios and toxicity has not been validated in clinical samples. Objective: To evaluate the use of plasma and saliva uracil (U) to dihydrouracil (UH2) metabolic ratios and DPYD genotyping, as a means to identify patients with dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) deficiency and fluoropyrimidine toxicity. Additionally, the work proposed the development of a bioanalytical method for the determination of U and UH2 by high-performance liquid chromatography. Methods: Paired plasma and saliva samples were obtained from 60 patients with gastrointestinal cancer before fluoropyrimidine treatment. U and UH2 concentrations were measured by LC-MS/MS. DPYD was genotyped for alleles *2A; Y186C; I560S, Y186C and *7. Results: 35% of the patients had severe toxicity. There was no variant allele carrier for DPYD. The [UH2]/[U] metabolic ratios were 0.09-26.73 in plasma and 0.08-24.0 in saliva, with higher correlation with toxicity grade in saliva compared to plasma (rs=-0.515 vs rs=-0.282). Median metabolic ratios were lower in patients with severe toxicity as compared to those with absence of toxicity (0.59 vs 2.83 plasma; 1.62 vs 6.75 saliva, P<0.01). A cut-off of 1.16 for salivary ratio was set with 86% sensitivity and 77% specificity for the identification of patients with severe toxicity. Similarly, a plasma cut-off of 4.0 revealed a 71% sensitivity and 76% specificity. Additionally, a bioanalytical method for the quantification of U and UH2, with adequate accuracy (98.4–105.3%) and precision (intra-assay CV 5.1–12.1% and inter-assay CV 5.3–10.1%) was develop and validated. Conclusions: DPYD genotyping for alleles *2A; Y186C; I560S, Y186C and *7 was not helpful in the identification of patients with severe DPD deficiency in this series of patients. The [UH2]/[U] metabolic ratios, however, proved to be a promising functional test to identify the majority of cases of severe DPD activity, with saliva performing better than plasma.