Resolução do conteúdo gênico dos elementos cromossômicos e delimitação dos pontos de quebra de inversões : uma abordagem citogenômica no organismo modelo Drosophila willistoni

Abstract

Droosphila willistoni é uma espécie pertencente ao subgênero Sophophora com origem e distribuição Neotropical. Esta espécie é um intrigante modelo biológico para diferentes pesquisas em genética evolutiva e de populações, evolução molecular e ecologia. Sua característica mais proeminente é a elevada ocorrência de polimorfismo cromossômico para inversões paracêntricas segregantes, sendo considerada por muitos especialistas como a espécie mais polimórfica do gênero Drosophila. O genoma da linhagem Gd-H4-1 de Drosophila willistoni, oriunda da Ilha Guadalupe (Caribe), foi sequenciado no Consórcio Drosophila 12 Genomes (2007). Nosso grupo de pesquisa do Laboratório de Drosophila da UFRGS é referência mundial no estudo da caracterização do polimorfismo cromossômico de Drosophila willistoni. A disponibilização do genoma desta espécie trouxe novos desafios e motivações para as análises envolvendo este organismo-modelo tão peculiar, especificamente no que concerne à gênese de suas inversões cromossômicas. O presente estudo visa delimitar, pela primeira vez, os pontos de quebra da inversão IIL-H do cromossomo II de Drosophila willistoni, na linhagem sequenciada Gd-H4-1, e na linhagem SG12.00 coletada no Uruguai e portadora da inversão IIL-H fixada. Esta delimitação é o primeiro passo para a subsequente caracterização molecular desta região, a fim de tentar inferir o possível mecanismo que originou esta inversão e as consequências genômicas que esta possa acarretar. A primeira análise comparou o padrão cromossômico do braço IIL entre a linhagem sequenciada Gd-H4-1 e o fotomapa de Drosophila willistoni, mostrando que o braço IIL da linhagem sequenciada apresenta os arranjos IIL-A e IIL-F fixados que o diferencia do arranjo do fotomapa. Dada a devida caracterização cromossômica da linhagem sequenciada, estabeleceu-se que esta seria o padrão para a análise dos pontos de quebra das inversões em Drosophila willistoni (Capítulo III, Tópico III.1). Para o estudo dos pontos de quebra da inversão IIL-H faz-se necessária a comparação destas regiões genômicas, entre a linhagem sequenciada padrão e outra linhagem de Drosophila willistoni que possua a inversão IIL-H fixada. Sendo assim, escolheu-se a linhagem SG12.00, a qual tinha seu padrão cromossômico caracterizado. Já o estabelecimento das diferenças do padrão cromossômico no braço IIL entre as duas linhagens foi obtido por cruzamentos recíprocos entre estas, mostrando que o braço IIL da linhagem SG12.00 difere do arranjo cromossômico da Gd-H4-1 pela ocorrência dos arranjos IIL-A, IIL-F e IIL-H fixados (Capítulo III, Tópico III.2). As análises acerca da montagem dos scaffolds do genoma do cromossomo II de Drosophila willistoni foram feitas a partir do estabelecimento de 18 sondas mapeadas fisicamente neste cromossomo da linhagem Gd-H4-1, por hibridação in situ não fluorescente. Adicionalmente, quatro sondas foram estabelecidas, uma para o braço cromossômico XL, uma para o cromossomo III, e duas para o braço cromossômico XR. Os resultados obtidos mudam a tradicional inferência dos Elementos de Muller respectivos aos braços IIL e IIR do cromossomo II de Drosophia willistoni, bem como mostram que a orientação dos scaffolds do braço cromossômico IIR estava invertida (Capítulo III, Tópico III.3 e Capítulo V). Para a delimitação dos genes flanqueadores dos pontos de quebra distal e proximal da inversão IIL-H de Drosophila willistoni foram executadas diferentes etapas de planejamento e estabelecimento de sondas gênicas e intergênicas, mapeadas fisicamente por hibridação in situ não fluorescente juntamente com a tentativa de delimitação dos pontos de quebra pela técnica da PCR. A delimitação do ponto de quebra proximal da inversão IIL-H foi mais laboriosa e complexa, mostrando que este ponto está envolvido com o reuso de uma sequência de aproximadamente 1.212 pb pelo ponto de quebra distal da inversão IIL-F, bem como a ocorrência da duplicação desta mesma sequência (Capítulo III, Tópico III.4).

Drosophila willistoni is a Neotropical species member of the Sophophora subgenus. This species is an interesting model organism for several researchers on evolutionary biology, population genetics, molecular evolution and ecology. This species is mainly characterized by its huge chromosomal polymorphism of paracentric segregating inversions, being considered by several experts as the most polymorphic Drosophila species. The genome of the Gd-H4-1 strain of Drosophila willistoni, collected in the Caribbean Guadaloupe Island, was sequenced by the Drosophila 12 Genomes Consortium (2007). Our research group at Drosophila Laboratory of the UFRGS, member of such Consortium, is worldwide recognized in the study of the chromosomal polymorphism of Drosophila willistoni. The availability of the Drosophila willistoni fully sequenced genome created new challenges and incentived the study of this special model organism, mainly respect to the genesis of its chromosomal inversions. For the first time, the present Thesis aimed to characterize detect and delineate the breakpoints of a chromosomal inversion in Drosophila willistoni - the IIL-H inversion in the Gd-H4-1 and in the Uruguayan SG12.00, a homozygous strain for the IIL-H inversion. This is the first step, for a further molecular characterization of this region, in order to reveal the possible mechanism that generated that inversion and the genomic consequences of this event. The first analysis here performed, compared the chromosomal banding pattern of the IIL arm with that of the sequenced Gd-H4-1 and those of the photomap of Drosophila willistoni, showing that IIL of the sequenced strain presents the IIL-A and IIL-F in homozygosis. Such characteristic differentiate Gd-H4-1 of the assumed standard arrangement. Considering the characterization of the sequenced strain, it was established that it should be considered as standard for the analysis of the breakpoints of the Drosophila willistoni inversions (Chapter III, Topic III.1). To determine the breakpoints of the IIL-H inversion, it was necessary to compare such regions with those of other strain of Drosophila willistoni, with the IIL-H inversion fixed in homozygosis, the Uruguayan strain SG12.00. The establishment of the precise difference between the chromosomal arrangements of the IIL arm of both strains was obtained through reciprocal crossings between them. It was observed that the IIL arm in the SG12.00 strain differ of that of the Gd-H4-1 strain, by the occurrence of the IIL-A, IIL-F e IIL-H fixed arrangements (Chapter III, Topic III.2). Analyses of the scaffolds assemblage of the chromosome II of Drosophila willistoni were performed through the use of 18 probes mapped by non-fluorescent in situ hybridization in the chromosomes of the Gd-H4-1 strain. Additionally, four other probes were hybridized, one in the XL chromosomal arm, one in the third chromosome and two in the XR arm. The results obtained in this study changed the traditional inference of the genic content of Muller Elements for the IIL and IIR chromosomal arms of Drosophia willistoni, and demonstrated that the orientation of the scaffolds of the chromosomal arm IIR was inverted (Chapter III, Topic III.3). To determine the genes flanking the distal and proximal breakpoints of the IIL-H inversion of Drosophila willistoni we followed several methodological steps. The first was the planning and the choice of probes of genic and intergenic sequences, and their physical mapping by non-fluorescent in situ hybridization and an attempt to define the breakpoints by PCR The delimitation of the proximal breakpoint of IIL-H was laborious and more complex, showing that this breakpoint is involved with the reuse of a 1.212 pb sequence by the distal breakpoint of the IIL-F invrsion, and is also involved with the duplication of this same sequence (Chapter III, Topic III.4).