Disfunção do sistema gabaérgico e da bomba NA+, K+ ATPase em neocórtex de modelo animal de acidemia glutárica tipo I

Abstract

A epilepsia é uma desordem neurológica que afeta aproximadamente 65 milhões de pessoas em todo o mundo. Apesar dos erros inatos do metabolismo (EIM) não serem a causa frequente de epilepsia, o sintoma mais comum presente em desordens metabólicas são crises epilépticas. Dentro dos EIM, estão as acidemias orgânicas que podem levar a geração de crises epiléticas durante um episódio de descompensação metabólica aguda, como por exemplo a acidemia glutárica tipo I (AG I). A AG I é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima glutaril-CoA desidrogenase (GCDH). Tal alteração leva ao acúmulo de ácidos orgânicos em fluidos e tecidos. Se não diagnosticada e tratada precocemente, a doença evolui com sinais clínicos de macrocefalia, déficits neurológicos e epilepsia. O aumento dos níveis de ácidos orgânicos no cérebro diminui a atividade da enzima Glutamato Descarboxilase (GAD) no parênquima cerebral e inibe a atividade da enzima Na+,K+,-ATPase. De acordo com estes achados, prévias análises bioquímicas de neocórtex e comportamentais de um modelo animal de AG I, camundongo nocaute para a enzima GCDH tratado com dieta com sobrecarga de lisina (4,7%) (Gcdh-/--Lis), mostram decréscimo do imunoconteúdo da GAD cortical, diminuição da liberação de ácido ϒ-aminobutírico (GABA) e diminuição da atividade Na+,K+,-ATPase e presença de crises epilépticas espontâneas Neste trabalho (aprovado pelo CEP-HCPA-140270) usamos este modelo animal de AG I para avaliar a função sináptica GABAérgica neocortical através de estudos eletrofisiológicos e bioquímicos, além de avaliar a expressão e o estado de fosforilação subunidade α da Na+,K+,-ATPase no neocórtex. A atividade da enzima GAD neocortical foi medida pela técnica de HPLC; as correntes inibitórias pós-sinápticas espontâneas e miniaturas (CIPS) nos neurônios piramidais foram avaliadas através da técnica eletrofisiológica de patch-clamp in vitro e avaliação da expressão total e a fosforilação do resíduo de Ser943 da Na+,K+,-ATPase neocortical foi feita através da técnica de Western Blot em camundongos Gcdh-/--Lis (P30-P45). Os resultados foram comparados com animais Gcdh-/- e Gcdh+/+ tratados com dieta normal (Gcdh-/--N e Gcdh+/+, respectivamente). Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa da atividade da GAD neocortical nos animais Gcdh-/--Lis quando compara aos animais Gcdh+/+ (P<0,05). A frequência das CIPS espontâneas e miniaturas nas células piramidais da camada V do neocórtex dos animais Gcdh-/-- Lis foi significativamente menor quando comparada às células dos animais Gcdh-/--N e Gcdh+/+ (P<0,0003). A curva de probabilidade cumulativa e a análise estatística de Kolmogorov-Smirnov confirmaram a diminuição na frequência das CIPS espontâneas e miniaturas (P<0,0001). A expressão da subunidade α da bomba Na+,K+-ATPase mostrou-se aumentada no neocórtex dos animais Gcdh-/--Lis quando comparada aos demais grupos (P<0,001). A avaliação do estado de fosforilação do resíduo de Ser943 revelou que os animais Gcdh-/--Lis apresentaram um aumento significativo da expressão do resíduo943 no neocórtex quando comparada aos demais grupos (P<0,001). Nossos dados sugerem que os animais Gcdh-/--Lis apresentam uma redução na transmissão sináptica GABAérgica neocortical que pode estar associada à disfunção da enzima GAD; e uma diminuição da atividade da bomba Na+,K+-ATPase neocortical possivelmente causada pela diminuição da expressão da enzima e pelo aumento da fosforilação do resíduo Ser943 da subunidade α no neocortical. Estas alterações em conjunto podem estar contribuindo para os mecanismos de epileptogênese na AG I.

The epilepsy is a neurological disorder that affects approximately 65 million people throughout the world. Despite of inborn errors of metabolism (IEM) not being a frequent cause of epilepsy, the most common symptom in metabolic disorders are epileptic seizures. Within the IEM, are the organic acidemias, such as, glutaric acidemia type I (GAI), that are associated with epileptic seizures during acute metabolic decompensation. The GAI is an autosomal recessive disease caused by deficiency of the enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase (GCDH).This deficiency leads to the accumulation of organic acids in body fluids and tissues. If not diagnosed and treated early, this disease evolves to neurological deficits, macrocephaly and epilepsy. The increased levels of organic acids in the brain, such as glutaric, glutaconic and 3-hydroxyglutaric acids, decreases the activity of the enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) in the brain parenchyma and cause the inhibition of the enzyme activity NA+,K+-ATPase. Interestingly, previous biochemical and behavioral analysis of an animal model of GAI, the GCDH knockout mice treated with lysine overload diet (4.7%) (Gcdh-/--Lis), had shown decreased GAD immune content, reduced GABA release and decreased activity Na+,K+-ATPase in the neocortex; and development of spontaneous seizures. In this work (approved by the CEP-HCPA-140270) we used this animal model to study the neocortical GABAergic synaptic function and the expression and the phosphorylation state of Na+,K+-ATPase α subunit in the neocortex. The GAD activity was measured by HPLC technique; the spontaneous and miniature inhibitory post-synaptic currents (IPSC) were evaluated by in vitro patch-clamping recordings from pyramidal cells; and the expression and the phosphorylation of total residue to Ser943 of Na+, K+- ATPase was performed by Western Blot in mice Gcdh-/--Lis (P30-P45). As controls we used Gcdh (Gcdh-/--N) and Gcdh+/+ animals treated with normal diet. Our results showed a significant decrease in the neocortical GAD activity in Gcdh-/--Lis mice when compared to Gcdh+/+ group (P<0.05). The spontaneous and miniature IPSC frequencies onto layer V pyramidal cells from Gcdh-/--Lis mice were significantly lower when compared to Gcdh-/--N and Gcdh+/+ mice (P<0.0003). The cumulative probability and the statistical analysis the Kolmogorov-Smirnov confirmed the decrease in the frequency of spontaneous and miniature IPSC (P<0.0001). The expression of Na+,K+-ATPase α subunit was higher in the neocortex from Gcdh-/--Lis when compared to the other groups (P<0.001). Also, the Gcdh-/--Lis mice had a significant increased fosforilation of Na+,K+-ATPase residual Ser943 in the neocortex when compared to the other groups (P<0.001). Our data suggested that the neocortex of Gcdh-/--Lys mice exhibited reduction in GABAergic inhibition that may be attributed to a GAD dysfunction level; and decreased Na+,K+-ATPase activity that could be caused by decrease in its expression and increased phosphorylation of residue Ser943 α subunit. Taken altogether, these alterations could contribute to the mechanisms of epileptogenesis observed in GAI.