Papel do estresse oxidativo na neurotoxidade da 5-oxoprolina e do ácido N-acetilaspártico em encéfalo de ratos

Abstract

A 5-oxoprolina (ácido L-piroglutâmico) se acumula na deficiência de glutationa sintetase, uma doença genética autossômica recessiva clinicamente caracterizada por anemia hemolítica, acidose metabólica e sintomas neurológicos severos. Considerando que os mecanismos de dano cerebral nessa doença são pouco conhecidos, e que recentemente demonstramos que a 5-oxoprolina é capaz de promover estresse oxidativo in vitro, resolvemos investigar os efeitos in vivo da 5-oxoprolina sobre parâmetros de estresse oxidativo, afim de melhor esclarecer seu papel na neurotoxicidade da 5-oxoprolina e sua participação nos mecanismos neuropatológicos da deficiência de glutationa sintetase. Para isso, os efeitos da administração subcutânea aguda de 5-oxoprolina foram estudados sobre o potencial antioxidante total (TRAP); a quimiluminescência espontânea; as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS); o conteúdo de carbonilas, ácido ascórbico, glutationa reduzida (GSH), peróxido de hidrogênio, tióis e dissulfetos (e a razão SH/SS), assim como sobre as atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx), e a atividade da glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PD) em córtex cerebral e cerebelo de ratos de 14 dias de vida Os resultados obtidos indicaram que in vivo a 5-oxoprolina causa lipoperoxidação e oxidação protéica, compromete as defesas antioxidantes cerebrais e aumenta o conteúdo de peróxido de hidrogênio, indicando que a 5-oxoprolina promove estresse oxidativo in vivo em córtex cerebral e cerebelo de ratos jovens, mecanismo possivelmente envolvido na neuropatologia da deficiência de glutationa sintetase, na qual a 5-oxoprolina está acumulada. O ácido N-acetilaspártico, por outro lado, se acumula na Doença de Canavan, uma leucodistrofia severa causada pela deficiência da enzima aspartoacilase e clinicamente caracterizada por retardo mental severo, hipotonia e macrocefalia, e também por convulsões tônico-clônicas generalizadas em aproximadamente metade dos pacientes. O ácido N-acetilaspártico é um precursor imediato para a biossíntese enzimática do ácido Nacetilaspartilglutâmico, cuja concentração também está elevada nos pacientes afetados pela Doença de Canavan. Considerando que os mecanismos de dano cerebral nessa doença permanecem pouco esclarecidos, investigamos o papel do estresse oxidativo na neurotoxicidade dos ácidos N-acetilaspártico e N-acetilaspartilglutâmico, a fim de avaliar o possível envolvimento dos mesmos na neuropatologia da Doença de Canavan. Os efeitos in vitro dos ácidos N-acetilaspártico e N-acetilaspartilglutâmico, assim como os efeitos das administrações subcutânea e intracerebroventricular (i.c.v.) de ácido N-acetilaspártico e da administração i.c.v. do ácido N-acetilaspartilglutâmico, foram estudados sobre os seguintes parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos: TRAP; TAR; quimiluminescência espontânea; TBA-RS; conteúdos de GSH, peróxido de hidrogênio, tióis totais e carbonilas; atividades das enzimas antioxidantes CAT, SOD e GPx; e atividade da G6PD. Os resultados indicaram que apenas o ácido N-acetilaspártico é capaz de aumentar o conteúdo de peróxido de hidrogênio, estimular a lipoperoxidação e a oxidação protéica e de comprometer as defesas antioxidantes em cérebro de ratos, promovendo estresse oxidativo, que pode estar envolvido nos mecanismos patofisiológicos responsáveis pelo dano cerebral observado nos pacientes afetados pela Doença de Canavan, cujo marcador bioquímico clássico é o acúmulo de ácido N-acetilaspártico.

5-Oxoproline (L-pyroglutamic acid) accumulates in glutathione synthetase deficiency, an autossomic recessive inherited disorder clinically characterized by hemolytic anemia, metabolic acidosis and severe neurological symptoms. Considering that the mechanisms of brain damage in this disease are poorly known, and that oxidative stress is elicited by 5-oxoproline in vitro, we decided to study the in vivo effects of this metabolite on oxidative stress parameters, in order to further clarify its role in 5-oxoproline neurotoxicity and its participation on the neuropathological mechanisms of patients affected by glutathione sintetase deficiency. The effects of acute subcutaneous administration of 5- oxoproline were studied on a wide spectrum of oxidative stress parameters, such as total radical-trapping antioxidant potential (TRAP); spontaneous chemiluminescence; thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS); and carbonyl, ascorbic acid, reduced glutathione (GSH), hydrogen peroxide, thiol and disulfide contents (and SH/SS ratio), as well as on the activities of the antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx), and on the activity of glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD) in cerebral cortex and cerebellum of 14-day-old rats. The results indicated that in vivo 5-oxoproline causes lipid peroxidation and protein oxidation, impairs brain antioxidant defenses and increases hydrogen peroxide content, indicating that 5- oxoproline elicits oxidative stress in vivo in cerebral cortex and cerebellum of young rats, a mechanism that may be involved in the neuropathology of gluthatione synthetase deficiency, in which this metabolite accumulates. N-acetylaspartic acid, on the other hand, accumulates in Canavan Disease, a severe leukodystrophy characterized by swelling and spongy degeneration of the white matter of the brain. This inherited metabolic disease, caused by deficiency of the enzyme aspartoacylase, is clinically characterized by severe mental retardation, hypotonia and macrocephaly, and also generalized tonic and clonic type seizures in about half of the patients. N-acetylaspartic acid is an immediate precursor for the enzyme-mediated biosynthesis of N-acetylaspartylglutamic acid, whose concentration is also increased in urine and cerebrospinal fluid of patients affected by Canavan Disease. Considering that the mechanisms of brain damage in this disease remain poorly understood, in the present study we investigated whether oxidative stress is elicited by N-acetylaspartic acid or its metabolite, N-acetylaspartylglutamic acid. The in vitro effects of N-acetylaspartic acid and N-acetylaspartylglutamic acid, as well as the effect of the acute subcutaneous administration of N-acetylaspartic acid, and the intracerebroventricular administration of Nacetylaspartic acid or N-acetylaspartylglutamic acid, were studied on oxidative stress parameters: TRAP, TAR, spontaneous chemiluminescence, TBA-RS, reduced glutathione content, sufhydryl content, carbonyl content, and on enzyme activities of CAT, SOD and GPx as well as on GSH and hydrogen peroxide contents and on G6PD activity, in the cerebral cortex of rats. Our results indicated that only N-acetylaspartic acid promotes oxidative stress by stimulating lipid peroxidation, protein oxidation and by impairing antioxidant defenses and enhancing hydrogen peroxide content in rat brain. This could be involved in the pathophysiological mechanisms responsible for the brain damage observed in patients affected by Canavan Disease, in which N-acetylaspartic acid accumulation is the biochemical hallmark.