Estudo da presença e identificação de ureases em cloroplastos das folhas de soja (Glycine max)

Abstract

Ureases (ureia amido-hidrolases; EC 3.5.1.5) são metaloenzimas, dependentes de níquel, produzidas por plantas, fungos, bactérias e invertebrados, que catalisam a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono. Em plantas e fungos, as ureases são hexâmetros formados por seis subunidades idênticas, e, em bactérias, são formadas por duas a três subunidades distintas. A presença de dois íons de níquel no sítio ativo das ureases é essencial para sua atividade catalítica. Em bactérias, ureases atuam como fatores de virulência em infecções do trato urinário e gastrointestinal. Em plantas, ureases são encontradas principalmente nas sementes, mas estão distribuídas em todos os tecidos. A soja produz duas isoenzimas: a urease embrião-específica, sintetizada no embrião, e a urease ubíqua, presente em todos os tecidos da planta, em menor quantidade que a embrião-especifica. Em estudos prévios realizados pelo grupo foram identificadas proteínas de plastídios que co-imunoprecipitaram associadas à urease, o que despertou o interesse em estudar a presença de ureases na organela. Nesse trabalho, estabeleceu-se o protocolo para purificação e enriquecimento de cloroplastos de folhas de soja para investigar a provável presença de ureases na organela. Ensaios de atividade enzimática, ELISA e cromatografia de troca iônica foram realizados com o extrato obtido de cloroplastos após o processo de extração e purificação e indicaram a presença de ureases nestes plastídeos. Na tentativa de identificar-se as isoformas de ureases presentes no cloroplasto, realizou-se ensaios de espectrometria de massas, porém não se obteve sucesso devido a quantidade da enzima presente no extrato. O aprimoramento do processo de enriquecimento de cloroplastos possibilitará prosseguir nos estudos para identificar as isoformas presentes na organela, bem como detectar sua localização nestas organelas.

Ureases (urea amido-hydrolases; EC 3.5.1.5) are nickel dependent metalloenzymes, produced by plants, fungi, bacteria and invertebrates, that catalyze the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide. In plants and fungi, ureases are hexamers formed by two or three identical subunits, while in bacterias are formed by two to three different subunits. The catalytic activity of urease is due to the presence of two nickel ions in its active site. Bacterial ureases are known virulence factors in urinary and gastrointestinal tracts. In plants urease are mainly found in the seeds, but are widely distributed in all tissues. Soybean produces two isoenzymes: embryo-specific urease is synthesized in the embryo during development and ubiquitous urease is present in all plant tissues, in a smaller amount compared to embryo-specific. Previous studies have shown that many plastid proteins co-immunoprecipitate with urease, which sparked interest in studying the presence of ureases in the organelle. In this study, we established the protocol for purification and enrichment of soybean leaves chloroplasts in order to investigate the presence of urease in the organelle. Enzymatic activity, ELISA and ion exchange chromatography assays were conducted with the organelle and indicated the presence of ureases. In an effort to identify which ureases isoforms were present in the chloroplast, we performed mass spectrometry analysis. This effort was unsuccessful due to small amount of enzyme obtained from the extract. Improving the enrichment process will enable further studies regarding the identification of the urease isoforms as their location in the plastid.