Efeito da mifepristona sobre a proliferação celular e expressão gênica de receptores de progesterona em um modelo de cultura primária de miométrio e leiomioma humanos

Abstract

Introdução: leiomiomas uterinos são os tumores benignos mais prevalentes nas mulheres em idade fértil, ocorrem em cerca de 50% da população feminina e são a indicação mais frequente de histerectomia. A importância dos esteroides ovarianos na etiologia dos leiomiomas está bem estabelecida; contudo, as contribuições relativas dos estrógenos e da progesterona no crescimento dos leiomiomas ainda são controversas. Muitos estudos têm apresentado evidências de que a progesterona seria mais importante do que os estrógenos para o desenvolvimento destes tumores, e antiprogestágenos como a mifepristona podem tornar-se uma nova possibilidade de tratamento conservador. Ensaios clínicos têm sugerido que a mifepristona é efetiva no tratamento de leiomiomas, causando redução no tamanho dos tumores. Todavia, a recorrência da proliferação dos tumores após o fim do tratamento e os mecanismos de ação da mifepristona na regulação dos receptores de progesterona ainda não estão esclarecidos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da mifepristona sobre a proliferação celular e a expressão gênica de receptores de progesterona A e B, em um modelo de cultura de células de miométrio e leiomioma, sob diferentes condições hormonais. Métodos: fragmentos de leiomioma e de miométrio adjacente foram obtidos de cinco pacientes submetidas à histerectomia. Foram padronizadas as culturas primárias de leiomioma e miométrio, e as células de cada tipo de tecido em cultura foram divididas em cinco grupos de tratamento: estradiol, estradiol e mifepristona, estradiol e progesterona, estradiol, progesterona e mifepristona e controle (etanol utilizado como veículo dos hormônios). Foi realizada análise imunocitoquímica para α-actina. A proliferação celular foi avaliada através de contagem em hemocitômetro e ensaio de MTT no tempo 7 (após o tratamento com mifepristona) e no tempo 9 (após a recuperação do tratamento). No dia 7, foi feita extração de RNA para avaliar a expressão de receptores de progesterona (PRs) A e B através de PCR em tempo real. Resultados: o estabelecimento do modelo de cultura de células foi confirmado através da coloração positiva para α-actina e pela observação de características morfológicas típicas de células musculares lisas. As técnicas de avaliação da proliferação celular, contagem e MTT, mostraram correlação positiva. O tratamento com estradiol aumentou a proliferação celular de ambos os tipos de tecido, em relação ao grupo controle. O tratamento com progesterona associada ao estradiol aumentou a proliferação das células de ambos tecidos, em relação ao tratamento com estradiol isoladamente e ao controle. Para os dois tratamentos, as células de leiomioma proliferaram mais do que as células de miométrio. No tempo 7, o tratamento com mifepristona associada ao estradiol inibiu a proliferação celular em leiomioma (42%) e no miométrio (23%), em comparação ao mesmo tecido tratado somente com estradiol. O tratamento com mifepristona em associação com estradiol e progesterona inibiu a proliferação celular em leiomioma (105%) e miométrio (56%), em comparação ao mesmo tecido tratado com estradiol e progesterona. No tempo 9, após a recuperação do tratamento com mifepristona, células de miométrio mostraram maior resposta proliferativa do que células de leiomioma. Todavia, o tratamento com mifepristona não foi capaz de inibir completamente a proliferação celular, visto que todos os grupos tratados mostraram aumento de proliferação do tempo 7 até o tempo 9. Foi demonstrada a expressão das duas isoformas de PRs, A e B, em miométrio e leiomioma in vitro; contudo, as comparações entre os grupos de tratamento não foram possíveis devido ao reduzido tamanho amostral. Conclusões: culturas primárias de células de miométrio e leiomioma são um modelo viável para avaliação da proliferação celular em diferentes condições hormonais, e o ensaio de MTT pode ser um bom método de avaliação. A mifepristona inibiu a proliferação celular em ambos os tipos de tecido, com o maior efeito quando associada ao estradiol e à progesterona e em células de leiomioma. Células de miométrio e leiomioma expressam as duas isoformas de PRs in vitro. Mais estudos são necessários para esclarecer o papel da mifepristona na regulação da expressão gênica e proteica dos PRs.

Introduction: uterine leiomyomata are the most common benign tumors in women of reproductive age, with an estimated incidence greater than 50% and being the most common indication for hysterectomy. Importance of ovarian steroids in the etiology of leiomyomas is well established; however, relative contributions of estrogens and progesterone in leiomyomas growth are still controversial. Many studies have presented evidences that progesterone is more important than estrogens for the development of these tumors, and antiprogestins like mifepristone have become a new possibility for conservative treatment. Clinical trials suggest that mifepristone is effective in treating leiomyomata, producing reduction of their size. However, recurrence of tumor proliferation after treatment and molecular mechanisms of mifepristone action in regulating progesterone receptors remains unknown. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of mifepristone on cell proliferation and progesterone receptors A and B gene expression, in a model of leiomyoma and matched myometrium cell cultures under different hormonal conditions. Methods: human leiomyoma and matched myometrial tissues were obtained from five patients undergoing hysterectomy. Cells maintened in culture from each tissue were divided into 5 treatment groups: estradiol, estradiol and mifepristone, estradiol and progesterone, estradiol, progesterone and mifepristone, and control group (ethanol as a vehicle from hormones). Immunocytochemistry analysis for α-actin was performed. Cell proliferation was evaluated by hemocytometer counting and MTT assay at day 7 (after mifepristone treatment) and day 9 (after recovery from treatment). RNA extraction was performed at day 7 to evaluate progesterone receptors (PRs) A and B expression by real time PCR. Results: culture cell establishment was confirmed by positive staining for α-actin and by observed morphological characteristics from smooth muscle cells. Cell proliferation evaluating techniques, hemocytometer counting and MTT, showed positive correlations. Estradiol treatment increased cell proliferation for leiomyoma and myometrium cells compared to control group. Progesterone combined to estradiol increased cell proliferation in both cell types, compared to estradiol alone and control group. For both hormonal treatments, leiomyoma showed significantly higher proliferation than myometrial cells. At day 7, mifepristone treatment in association with estradiol inhibited cell proliferation in leiomyoma (42%) and myometrial cells (23%), compared to the same tissue treated with estradiol alone. Mifepristone treatment in association with estradiol and progesterone also inhibited cell proliferation in leiomyoma (105%) and myometrial cells (56%), compared to the same tissue treated with estradiol and progesterone. At day 9, after recovery from mifepristone treatment, myometrial cells showed greater proliferative response than leiomyoma cells. However, mifepristone treatment was not able to completely inhibit cell proliferation, whereas treated groups showed increased proliferation from day 7 to 9. We have found that two isoforms of PRs, A and B, were expressed in both myometrial and leiomyoma in vitro; however, comparisons between groups were not possible due to the small sample size. Conclusions: primary myometrial and leiomyomata cell cultures are a viable model for cell proliferation analysis under different hormonal conditions, and MTT assay could also be a good evaluation method. Mifepristone inhibited cell proliferation of both types of tissue, with maximum effect in association with estradiol and progesterone in leiomyoma cells. PRs A and B were expressed in myometrial and leiomyoma cells in vitro. Further investigation is needed to clarify whether mifepristone regulates gene and protein expression of PRs.