Endopeptidases da Canavalia ensiformis : um estudo da germinação e estágios iniciais da plântula

Abstract

Endopeptidases de diversas classes da semente quiescente e plântulas de Canavalia ensiformis foram investigadas neste trabalho. Aplicando técnicas de purificação e caracterização de proteínas identificamos e isolamos endopeptidases representantes de aspártico endopeptidases, serino endopeptidases, e uma enzima forte candidata à ser uma sedolisina, uma família de endopeptidases serínicas ainda não descrita em plantas. Também investigamos a mobilização da urease/canatoxina, isoformas de proteínas inseticidas presentes nas sementes da Canavalia ensiformis. Por estudos de auto-digestão e análise por técnicas imunoquímicas, foi possível observar a ação de enzimas atuantes em pH 4 sobre a urease/ canatoxina.Os fragmentos derivados da urease formados pelas enzimas da própria planta são diferentes do fragmento liberado pela hidrólise da canatoxina por catepsinas digestivas nos insetos suscetíveis alimentados com a proteina. Duas enzimas atuantes em pH ácido forma caracterizadas, sendo que o nterminal e fragmentos oriundos por hidrólise tríptica da enzima de C. ensiformis sensível à tirostatina revelaram similaridade com metaloproteínas e metaloproteases. Também foi possível a caracterização de uma atividade serino endopeptidásica presente ao longo de todo o processo germinativo e de desenvolvimento inicial da planta. Concluímos que a Canavalia ensiformis possui diversos sistemas enzimáticos atuando durante a germinação, e que a urease foi hidrolisada por enzimas endógenas da planta em pH ácido, da mesma forma que acontece nos insetos suceptíveis ao efeito tóxico da proteína, mas liberando fragmentos diferentes. Entre as endopeptidases da planta caracterizadas neste trabalho, identificamos uma enzima com características de uma sedolisina, uma família de proteínas ainda não descrita em vegetais.

Endopeptidases from the quiescent seed and early stages of developing Canavalia ensiformis plants were studied in this work. Using raw protein extract purification and separation approaches, we were able to characterize aspartic and serine endopeptidases. An enzyme with characteristics to be a candidate of sedolisin family, which belongs to serine endopeptidase class, was also characterized. This enzyme family was not described in plants yet. The mobilization of urease/canatoxin, isoforms of an entomot oxic protein, present in Canavalia seeds, was also investigated. Using immunological techniques, we demonstrated that urease/ canatoxin is hydrolyzed by endogenous acidic enzymes which release peptides different from those formed by cathepsins B and D in susceptible insects fed with the insecticidal protein. Two acidic enzymes were purified and characterized. The N-terminal sequence and MS-analysis of trypsin peptides of a tyrostatin sensitive enzyme indicate its similarity with metaloproteins and metalloproteinases. Serine endopeptidase activities found in the quiescent seed and during early stages of germination and in developing plants were also described. In summary, different enzymatic mechanisms participate in germination and early development of Canavalia ensiformis plants. Urease /canatoxin was hydrolyzed by acidic endopeptidases present in the seed but the released fragments are different from those formed by insect digestive enzymes. Among the endopeptidases described in this work we found evidences of the presence of a sedolisin, a type of enzyme so far reported in plants.