Monitoramento molecular bacteriológico de ratos Wistar

Abstract

Os fatores microbiológicos são importantes para o desenvolvimento do bem estar dos animais de laboratório. Muitos patógenos interferem nos resultados de estudos e muitas zoonoses não apresentam sinais clínicos, representando um risco para a saúde dos animais e das pessoas que os cuidam. Logo, é necessário programas de monitoramento sanitário, capazes de possibilitar a detecção de patógenos nos animais mantidos em biotérios. Uma das metas do Centro de Reprodução e Experimentação de Animais de Laboratório (CREAL) é a realização de monitoramento sanitário microbiológico dos animais criados neste Centro. Assim, este projeto visa à padronização das metodologias e técnicas para a investigação de bactérias patogênicas específicas e da microbiota bacteriana cultivável em aerobiose de origem respiratória e fecal presente em ratos Wistar criados no CREAL em sistemas de alojamento do tipo IVC e convencionais. Foram coletadas amostras de lavado traqueal, de fezes e de suabe da traqueia e do ceco de 20 animais. As amostras de suabe foram semeadas em sete tipos de meio de cultura e as colônias isoladas. A extração de DNA das colônias foi testada por meio de fervura a 100ºC em água ou em solução de Tris-EDTA (TE), de fervura em água com posterior incubação com proteinase K (PK) e de incubação apenas com PK. Após, o DNA obtido foi utilizado em reações de PCR utilizando marcador molecular 16S RNAr para o Domínio Bacteria. A extração do DNA de amostras de lavado traqueal e de fezes foi testada utilizando o método com fenol-clorofórmio e kits comerciais. Para a padronização das reações de PCR para detecção patogênica foram utilizados marcadores moleculares para o gene 16S RNAr e para os genes específicos de um grupo de patógenos. A reação de PCR das colônias foi padronizada com a utilização de DNA extraído pelo método de fervura em solução de TE ou, como alternativa, pelo método de lise com PK. Foram isoladas 493 colônias de bactérias, sendo que foi possível a amplificação do DNA em 412 amostras. A extração do DNA de amostras de lavado traqueal apresentou melhores resultados com a utilização do kit da marca Stratec, já para amostras de fezes com o método fenol-clorofórmio. As reações de PCR para detecção dos patógenos específicos apresentaram produtos inespecíficos, apesar da amplificação de produtos esperados. Os produtos gênicos obtidos devem ser sequenciados para a confirmação da detecção e validação das técnicas.