Estudo da ação da proteína HSP70 extracelular sobre o receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE) em modelo celular

Abstract

A sepse é uma síndrome complexa, disparada pela infecção microbiana causada por um patógeno e é induzida pela ativação progressiva e sistêmica de múltiplas vias de respostas inflamatórias, resultando na disfunção aguda de alguns órgãos e culminando em falência múltipla. Pacientes sépticos apresentam uma alta taxa de ativação de macrófagos na corrente sanguínea que, em resposta aos sinais pró-inflamatórios, passam a produzir citocinas anti-inflamatórias. A resposta inflamatória é essencial para o combate bacteriano, mas em casos extremos, uma reação exacerbada pode levar ao choque séptico. O receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE) é uma proteína transmembrana multi-ligante da superfamília das imunoglobulinas; é descrito que durante a sepse ocorre um aumento na concentração plasmática dos ligantes deste receptor. Um dos efeitos principais da ativação de RAGE é a ativação redox-dependente de NF-kB, a qual leva à produção de TNF-α, sendo este um processo de retroalimentação positiva; tal mecanismo vem sendo sugerido como o eixo principal da intensificação/perpetuação de estados pró-inflamatórios. Esse trabalho visa elucidar a relação causal entre estresse oxidativo e HSP70 extracelular em um modelo celular de sepse, avaliando a modulação de tal mecanismo por via de RAGE. A linhagem celular de macrófagos RAW 264.7 foi desafiada com HSP70 e agonistas de RAGE, o que resultou na ativação da cascata de sinalização das MAPK. A fim de avaliar o parâmetro tempo/resposta, a proteína HSP70 foi adicionada às células em diferentes momentos, e a imunodetecção de cinases foi realizada. A expressão de RAGE foi validada em nossa linhagem de estudo na presença de LPS por um período de 24h, onde verificamos um aumento significativo nos níveis de RAGE. Com a finalidade de atenuar a expressão deste receptor, utilizou-se siRNA como ferramenta de silenciamento gênico; a eficiência da técnica foi baixa, uma vez que não se verificou diferença estatística nos níveis de expressão de RAGE nas células RAW 264.7.

Sepsis is a complex syndrome, triggered by microbial infection caused by a pathogen and is induced by progressive and systemic activation of multiple pathways of inflammatory responses, resulting in acute dysfunction of some organs and culminating in multiple death. Septic patients have a high ratio of activation of macrophages in the bloodstream, which in response to proinflammatory signals, start producing antiinflammatory cytokines. The inflammatory response is essential for bacterial decase, but in extreme cases, an enhanced response can lead to septic shock. The receptor for advanced glycation end products (RAGE) is a multi-transmembrane binding protein of the immunoglobulin superfamily; it is described that during sepsis there is an increase in the plasma concentration of the ligands of this receptor. One of the main effects of activation of RAGE is the redox-dependent NF-kB activation, which leads to production of TNF-α, which is a positive feedback process; such mechanism has been suggested as the main axis stepping / perpetuation of proinflammatory states. The purpose of this work is to elucidate the causal relationship between oxidative stress and extracellular HSP70 in a cell model of sepsis, by assessing the modulation of such mechanism via RAGE. The macrophages cell line RAW 264.7 were challenged with HSP70 and agonists of RAGE, resulting in activation of the MAPK signaling cascade. To evaluate time/response parameter, HSP70 protein was added to the cells at different times, immunodetection of kinases was performed. The expression of RAGE was validated in our lineage study in the presence of LPS for a period of 24 hours, where we found a significant increase in the RAGE’s level. In order to attenuate the expression of this receptor, we used siRNA gene silencing as a tool; the technique efficiency was low, since there was no statistical difference in the expression levels of RAGE in RAW 264.7 cells.