Amplificação do DNA bacteriano no diagnóstico da infecção da ascite em crianças e adolescentes com hipertensão porta

Abstract

No grupo pediátrico, as principais causas de ascite são aquelas relacionadas à hipertensão do sistema porta, especialmente a cirrose de causas variadas. O desenvolvimento de ascite está associado a algumas complicações como a hiponatremia dilucional, a insuficiência renal funcional e a infecção da ascite. Na ausência de uma causa cirúrgica ou intra-abdominal de peritonite, distinguem-se duas formas principais de infecção da ascite: a peritonite bacteriana espontânea (PBE) e a bacteriascite (BA). Define-se a PBE como aquela situação associada a uma contagem de polimorfonucleares (PMN) na ascite > 250 células/μL. A BA é diagnosticada quando a cultura da ascite é positiva, na presença de uma quantidade de PMN na ascite < 250 células/μL. Como a cultura convencional da ascite mostra baixa sensibilidade, sua positividade não é necessária ao diagnóstico da PBE. O advento da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) tem permitido a detecção de microrganismos em baixas concentrações, de cultivo exigente, demorado ou não disponível.O objetivo geral deste estudo foi comparar os resultados do método de amplificação da subunidade 16S do gene rRNA com aqueles obtidos pela técnica de cultura automatizada (BACTEC 9240) no diagnóstico de PBE, em crianças e adolescentes com ascite por hipertensão porta (gradiente albumina soro-ascite > 1,1 g/dl), acompanhados na unidade de gastroenterologia pediátrica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Foram estudados 31 pacientes e 40 paracenteses. A mediana da idade foi de 2,9 anos (intervalo interquartílico: 0,8-8,5 anos). Dezesseis pacientes foram do sexo masculino. Vinte e quatro pacientes eram cirróticos e, destes, vinte foram classificados com Child-Pugh C. A mediana do escore PELD foi de 18,5 (intervalo interquartílico: 0,8 – 8,5 anos). Aproximadamente, 10 mL de ascite foram inoculados, à beira do leito, em frascos de cultura, e incubados no sistema BACTEC 9240. Cerca de 20 mL da amostra foram enviados ao laboratório para a realização da coloração de Gram, para a análise bioquímica, para a contagem total e diferencial de células e para o estudo citopatológico. Simultaneamente, 10 a 30 mL de ascite foram estocadas a – 20o C para detecção do DNA bacteriano. Após extração do DNA com Trizol, a técnica de amplificação foi realizada utilizando-se primers para o gene 16S rRNA. Houve 12 episódios de ascite infectada (8 PBE e 4 BA). A cultura foi positiva em 4/8 casos de PBE. A sensibilidade, a especificidade e os valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN) da cultura para o diagnóstico de PBE foram 50%; 87,5%, 50,0% e 87,5%, respectivamente. A técnica de amplificação do DNA bacteriano foi positiva em 7/8 casos dePBE, em 3/4 casos de BA e em 8 casos que apresentavam ascite com cultura negativa e não neutrocítica (ACNNN). A sensibilidade, a especificidade, o VPP e o VPN da PCR no diagnóstico de PBE foram 85,7%, 65,6%, 38,8% e 95,5%, respectivamente. Os pacientes com ACNNN foram classificados de acordo com os resultados do DNA bacteriano e comparados em relação ao escore PELD, ao gradiente de albumina soro-ascite e à mortalidade em três meses. Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada. Concluímos que o método molecular foi mais sensível do que o da cultura no diagnóstico de PBE, podendo se constituir em um teste de triagem dessa complicação. A detecção de DNA bacteriano em 8 pacientes com ACNNN suscita questões a respeito da utilidade do teste também no diagnóstico de BA.

Cirrhosis is the most important cause of portal hypertensive ascites in children. The development of ascites in these patients is related to several complications such as dilutional hyponatremia, functional renal failure and infection of ascites. In the absence of secondary bacterial peritonitis, there are two forms of infected ascites: spontaneous bacterial peritonitis (SBP) defined as a polymorfonuclear (PMN) cell count in ascites > 250/μL and bacterascites (BA) defined as a positive ascites culture with a PMN count < 250 cells/μL. Because ascites culture is often negative, the positivity of ascites culture is not necessary to diagnose SBP. The main applications of the polymerase chain reaction (PCR) include the detection of bacteria in low concentrations, fastidious bacterial pathogens and the detection of slowly growing bacteria. The aim of this study was to compare the amplification of 16S rRNA gene with the BACTEC culture in the diagnosis of SBP, in pediatric patients with portal hypertension ascites (a serum to ascites albumin gradient > 1.1 g/dL) attending the pediatric gastroenterology unit at Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Thirty-one patients and forty paracentesis were studied. The median age of patients was 2.9 years (interquartílicoe range: 0.8-8.5). Sixteen patients were male. Cirrhosis of several causes was presented in 24 patients, 20 were classified as Child-Pugh C and the median of PELD score was 18.5 (interquartil range:10.0-27.5). Bacterial aerobic and anaerobic cultures were obtained by bedside inoculation of 10 mL of ascitic fluid into culture bottles wihich were incubated in BACTEC 9240 culture system. A volume of 20 mL of ascites was send to laboratory for the biochemical analyses, Gram’s stain, total and differential cell counts and citology. Simultaneously, 10 to 30 mL of ascites was stored at - 20o C to posterior bacterial DNA detection. After DNA extraction, detection of bacterial DNA was performed using primers for 16S rRNA gene. There were twelve episodes of infected ascites (8 SBP and 4 BA). Culture was positive in 4/8 cases of SBP. The molecular technique was positive in 7/8 cases of SBP and 3/4 cases of BA. For the diagnoses of SBP, the sensitivity, specificity positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of BACTEC culture was 50%, 87.5%, 50% and 87.5%, respectively. The sensitivity, specificity, PPV and NPV of bacterial DNA was 87.5%, 65.6%, 38.8% and 95.5%. Eight patients with culture-negative nonneutrocytic ascites (CNNNA) had positive bacterial DNA.They are not different of those with CNNNA and negative bacterial DNA in respect of PELD score, serum to albumin ascites gradient or mortality in three month. In conclusion, the amplification of 16S rRNA gene was most sensitive than BACTEC culture in the diagnosis of SBP. The finding of positive bacterial DNA in patients with CNNNA indicates that the method could be useful in the diagnoses of BA as well.