Efeito de variantes nos genes de reparo do DNA como fatores modificadores da idade de início na Doença de Machado Joseph

Abstract

A Ataxia Espinocerebelar do tipo 3, também conhecida como Doença de Machado-Joseph (SCA3/MJD), é a doença neurodegenerativa autossômica dominante mais comum entre as ataxias. A SCA3/MJD é causada por uma expansão da repetição trinucleotídica CAG (CAGexp) no gene ATXN3, e o tamanho dessa repetição se correlaciona inversamente com a idade de início da doença. No entanto, a expansão explica apenas cerca de 55-65% dessa variação, indicando que outros fatores genéticos e ambientais também desempenham um papel na determinação do início dos sintomas. Estudos em outras doenças devido a CAGexps sugeriram uma possível associação entre proteínas de reparo de DNA e a modulação da idade de início nas doenças devido à CAGexps, através de sua influência na instabilidade da expansão. Uma das principais vias envolvidas foi a do Mismatch Repair (MMR – Reparo de Pareamento Incorreto). Diante disso, o objetivo deste estudo foi investigar variantes nos genes desta via de reparo e avaliar sua associação com a modulação da idade de início da SCA3/MJD. Escolhemos as variantes rs1799977 (MLH1), rs175080 (MLH3), rs2303425 (MSH2), rs2250063 (MSH3), rs1042821 (MSH6), rs3791767 (PMS1) e rs1805323 (PMS2), uma em cada um dos genes MMR. Embora nunca tenham sido estudadas antes na SCA3/MJD, essas variantes tiveram efeitos funcionais em outras condições e teriam frequências alélicas provavelmente adequadas para garantir algum poder ao nosso estudo. Além dos genes do complexo MMR, acrescentamos outros dois genes que haviam demonstrado ter um efeito modulador sobre a idade de início da nossa coorte SCA3/MJD, atuando em conjunto e aparentemente também através do reparo do DNA: a variante rs3512 em FAN1e alelos CAG intermediários em ATXN2 (>26 repetições). Trezentos e cinquenta e seis indivíduos sintomáticos foram selecionados nos bancos de dados da coorte SCA3/MJD do Rio Grande do Sul e a seguir convidados a participar do estudo, por terem a idade de início da ataxia de marcha (AOga, do inglês “Age at Onset of Gait Ataxia”) já conhecida, uma CAGexp já medida e igual ou menor que 80 repetições, as CAGn já medidas no ATXN2 e uma amostra de DNA guardada em biorrepositório da instituição. Todos participaram do estudo. A amplificação do DNA foi feita por meio de PCR em tempo real. As genotipagens de rs1799977 (MLH1), rs175080 (MLH3), rs2303425 (MSH2), rs2250063 (MSH3), rs1042821 (MSH6), rs3791767 (PMS1), rs1805323 (PMS2) e rs3512 (FAN1) foram realizadas com o TaqMan SNP Genotyping Assay, seguindo as instruções do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Associações com p < 0,05 foram consideradas significativas. A escolha do modelo funcional foi baseada na distribuição inicial da idade de início da AOga entre os genótipos, considerando padrões de dominância, efeito de dose ou heterozigosidade. As análises foram conduzidas por regressão linear, com o tamanho da expansão CAG em ATXN3 incluído como covariável, e as médias marginais estimadas (MMEs) foram calculadas para um CAGexp de referência de 75 repetições, com comparações pareadas ajustadas entre genótipos. Para variantes significativas, também foram avaliadas interações gene–gene e análises estratificadas por sexo, sendo adotado p < 0,05 como limiar de significância. Identificamos efeitos protetores em ATXN2 (≤26 CAG com AOga média de 36,9 anos vs. >26 repetições com 29,1 anos; p = 4,6 × 10−5) e em MLH1 (AG com 37,6 anos vs. AA com 35,7 anos; p = 0,048). Já em MSH3, observou-se um efeito de risco nos heterozigotos CT (35,3 anos vs. CC com 37,4 anos; p = 0,044), confirmando padrões de dominância e subdominância. A análise estratificada por sexo em MSH3 mostrou que a desvantagem da heterozigosidade CT foi mais pronunciada em homens (mulheres: 36,48 anos vs. homens: 33,97 anos; p = 0,034), assim como no genótipo TT (mulheres: 39,06 anos vs. homens: 33,79 anos; p = 0,016), indicando possível relevância clínica. A análise de interação entre genes revelou efeitos aditivos. Na combinação MLH1+ATXN2, portadores de ambos os alelos protetores apresentaram AOga mais tardia (38,06 anos) em comparação aos portadores isolados (28,88 anos para MLH1 e 36,8 anos para ATXN2; p = 0,050). De forma semelhante, na interação MSH3+ATXN2, indivíduos com ambos os alelos protetores tiveram início ainda mais tardio (38,24 anos) em relação aos portadores isolados (29,05 anos para MSH3; p = 0,011), indicando que a presença simultânea de variantes protetoras em genes do MMR potencializa o efeito do ATXN2. É importante pontuar, no entanto, que as interações aqui apresentadas são eventos estatísticos e não necessariamente biológicos. Não é possível garantir que os efeitos sejam de fato aditivos. Em conclusão, até onde sabemos, nossos resultados fornecem as primeiras evidências de que variantes nos genes da via de MMR influenciam a AOga da SCA3/MJD. A associação prévia entre antecipação da AOga e rs3512 em FAN1 em conjugação com alelos intermediários no ATXN2 observada em 144 casos da nossa coorte, relatados em 2019, não foi confirmada agora que a mesma coorte foi aumentada para 263 casos. O aumento do tamanho amostral, obtido no presente estudo, parece ter sido a principal razão para isso, ao corrigir vieses estocásticos inadvertidos no relato de 2019. Nossos achados sugerem que as instabilidades somáticas reparadas pelo sistema MMR desempenham um papel importante no processo patogênico da doença.

Spinocerebellar ataxia type 3, also known as Machado-Joseph disease (SCA3/MJD), is the most common autosomal dominant neurodegenerative disease among the ataxias. SCA3/MJD is caused by an expansion of the CAG trinucleotide repeat (CAGexp) in the ATXN3 gene, and the size of this repeat correlates inversely with the age at disease onset. However, the expansion explains only about 55–65% of this variation, indicating that other genetic and environmental factors also play a role in determining the onset of symptoms. Studies in other diseases due to CAGexps have suggested a possible association between DNA repair proteins and modulation of age at onset in diseases due to CAGexps, through their influence on expansion instability. One of the main pathways involved was Mismatch Repair (MMR). Therefore, the aim of this study was to investigate variants in the genes of this repair pathway and evaluate their association with the modulation of age at onset in SCA3/MJD. We chose the variants rs1799977 (MLH1), rs175080 (MLH3), rs2303425 (MSH2), rs2250063 (MSH3), rs1042821 (MSH6), rs3791767 (PMS1), and rs1805323 (PMS2), one in each of the MMR genes. Although never studied before in SCA3/MJD, these variants had functional effects in other conditions and would have allele frequencies likely adequate to ensure some power to our study. In addition to the genes of the MMR complex, we added two other genes that had demonstrated a modulatory effect on age at onset in our SCA3/MJD cohort, acting together and apparently also through DNA repair: the rs3512 variant in FAN1 and intermediate CAG alleles in ATXN2 (>26 repeats). Three hundred and fifty-six symptomatic individuals were selected from the SCA3/MJD cohort databases of Rio Grande do Sul and then invited to participate in the study, as they already had a known age at onset of gait ataxia (AOga), a previously measured CAGexp equal to or less than 80 repeats, CAGn already measured in ATXN2, and a DNA sample stored in the institutional biorepository. All participated in the study. DNA amplification was performed by real-time PCR. Genotyping of rs1799977 (MLH1), rs175080 (MLH3), rs2303425 (MSH2), rs2250063 (MSH3), rs1042821 (MSH6), rs3791767 (PMS1), rs1805323 (PMS2), and rs3512 (FAN1) was performed with the TaqMan SNP Genotyping Assay, following the manufacturer’s instructions (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Associations with p < 0.05 were considered significant. The choice of functional model was based on the initial distribution of AOga among genotypes, considering patterns of dominance, dosage effect, or heterozygosity. Analyses were conducted by linear regression, with the size of the CAG expansion in ATXN3 included as a covariate, and estimated marginal means (EMMs) were calculated for a reference CAGexp of 75 repeats, with adjusted pairwise comparisons between genotypes. For significant variants, gene–gene interactions and sex-stratified analyses were also evaluated, with p < 0.05 adopted as the threshold for significance. We identified protective effects in ATXN2 (≤26 CAG with mean AOga of 36.9 years vs. >26 repeats with 29.1 years; p = 4.6 × 10−5) and in MLH1 (AG with 37.6 years vs. AA with 35.7 years; p = 0.048). In MSH3, a risk effect was observed in CT heterozygotes (35.3 years vs. CC with 37.4 years; p = 0.044), confirming patterns of dominance and subdominance. The sex-stratified analysis in MSH3 showed that the disadvantage of CT heterozygosity was more pronounced in males (females: 36.48 years vs. males: 33.97 years; p = 0. The sex-stratified analysis in MSH3 showed that the disadvantage of CT heterozygosity was more pronounced in males (females: 36.48 years vs. males: 33.97 years; p = 0.034), as well as in the TT genotype (females: 39.06 years vs. males: 33.79 years; p = 0.016), indicating possible clinical relevance. The gene interaction analysis revealed additive effects. In the MLH1+ATXN2 combination, carriers of both protective alleles presented later AOga (38.06 years) compared to isolated carriers (28.88 years for MLH1 and 36.8 years for ATXN2; p = 0.050). Similarly, in the MSH3+ATXN2 interaction, individuals with both protective alleles had an even later onset (38.24 years) compared to isolated carriers (29.05 years for MSH3; p = 0.011), indicating that the simultaneous presence of protective variants in MMR genes enhances the effect of ATXN2. It is important to note, however, that the interactions presented here are statistical events and not necessarily biological. It is not possible to guarantee that the effects are truly additive. In conclusion, to our knowledge, our results provide the first evidence that variants in MMR pathway genes influence AOga in SCA3/MJD. The previous association between anticipation of AOga and rs3512 in FAN1 in conjunction with intermediate alleles in ATXN2 observed in 144 cases of our cohort, reported in 2019, was not confirmed now that the same cohort was increased to 263 cases. The increase in sample size obtained in the present study seems to have been the main reason for this, by correcting inadvertent stochastic biases in the 2019 report. Our findings suggest that somatic instabilities repaired by the MMR system play an important role in the pathogenic process of the disease.