P5CS em foco : evolução estrutural-funcional, regulação da expressão e dinâmica de ganho e perda de genes

Abstract

The P5CS gene, encoding the Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthase enzyme, is responsible for initiating proline biosynthesis from glutamate. In plants, P5CS also has important metabolic connections such as in redox balance and in response to abiotic and biotic stresses. The P5CS enzyme has two catalytic domains and originated from a fusion event between the γ-GK and γ-GPR enzymes. Plants, animals, and some unicellular eukaryotes possess the P5CS gene, whereas prokaryotes, fungi, and some algae encode the non-fused enzymes (γ-GK and γ-GPR). In plants, it is common to find a pair of P5CS gene paralogs, which originated from several independent duplication events, and it is hypothesized that whole-genome duplication (WGD) events are the main source of P5CS duplication. This thesis aimed to explore the structural evolution, evolutionary patterns of gene gain and loss, and molecular mechanisms involved in the regulation of P5CS expression, to gain insights into its physiological and adaptive relevance in plants. In the first chapter, we used structural biology to understand the possible implications and advantages of the fusion that gave rise to the P5CS gene. In this chapter, we compared plant, animal, and trypanosomatid P5CS with the non-fused (γ-GK and γ-GPR) enzymes from yeast and bacteria. The structural analysis reinforces the existence of a single fusion event for the origin of P5CS, and ruled out the possibility that the fusion occurred in any eubacterial lineage. Furthermore, we proposed for the first time the catalytic mechanism of the GPR domain. In the second chapter, we explored the dynamics of P5CS duplications and losses in plants. In this chapter, we used the order Myrtales as a model, due to the existence of a WGD event in the common ancestor of the order and because previous studies indicated the presence of a single P5CS in the Myrtaceae family. P5CS was recovered in 100 species, covering five of the nine families of the order. The phylogeny of these sequences showed us four independent P5CS duplication events and at least three loss events within the Myrtales. Synteny analyses indicated that two of these four events originated from WGD. In addition, the analysis of cis-regulatory elements in the Myrtales showed enrichment in families of transcription factors commonly involved in stress response, such as MYB, ERF, and bZIP. In the third chapter, we explored the regulatory axis through the study of MYB transcription factors in Eugenia uniflora, a Myrtaceae species that possesses a single P5CS gene. This species is widely distributed and occurs in diverse environmental conditions, such as restinga and riparian forests. One hundred forty-seven MYB genes were identified in the E. uniflora genome, of which 50 were found to be differentially expressed under drought stress. Subsequently, we identified the potential EunMYB genes that act in the regulation of P5CS in E. uniflora, integrating literature data with evolutionary and transcriptomic aspects. Together, this thesis synthesizes structural, evolutionary, and regulatory aspects involving the P5CS gene, showing that a broad approach is essential for understanding the evolution and diversification of genes.

O gene P5CS, codificante da enzima Δ 1 -pirrolina-5-carboxilato sintase, é o responsável por iniciar a biossíntese de prolina a partir do glutamato. A enzima P5CS ainda possui importantes conexões metabólicas como no balanço oxi-redutor e na resposta a estresses abióticos e bióticos. A enzima P5CS possui dois domínios catalíticos e se originou de um evento de fusão entre as enzimas γ-GK e γ-GPR. Plantas, animais e alguns eucariotos unicelulares, possuem o gene P5CS, enquanto que os procariotos, fungos e algumas algas codificam as enzimas não-fusionadas (γ-GK e γ-GPR). Nas plantas é comum encontrar um par de parálogos do gene P5CS, que se originaram de diversos eventos de duplicações independentes, sendo hipotetizado que eventos de duplicação de genoma completo (WGD) são a principal fonte de duplicação do P5CS. Essa tese teve como objetivo explorar a evolução estrutural, padrões evolutivos de ganho e perda de genes e mecanismos moleculares envolvidos na regulação da expressão de P5CS, para ganhar insights sobre sua relevância fisiológica e adaptativa em plantas. No primeiro capítulo utilizamos a biologia estrutural para compreender as possíveis implicações e vantagens da fusão que originou o gene P5CS. Nele realizamos a comparação da P5CS de plantas, animais e tripanossomatídeos, com as enzimas não-fusionadas (γ-GK e γ-GPR) de levedura e bactérias. A análise estrutural reforça a existência de um único evento de fusão para a origem do P5CS, e com ela descartamos a possibilidade da fusão ter ocorrido em alguma linha eubacteriana. Além disso, propomos pela primeira vez o mecanismo catalítico do domínio GPR. No segundo capítulo, exploramos a dinâmica de duplicações e perdas do P5CS nas plantas. Nele usamos como modelo a ordem Myrtales, devido a existência de um evento de WGD no ancestral comum da ordem e por estudos anteriores apontarem a presença de um único P5CS na família Myrtaceae. O P5CS foi recuperado em 100 espécies, abrangendo cinco das nove famílias da ordem. A filogenia destas sequências nos mostrou quatro eventos independentes de duplicação do P5CS e ao menos três eventos de perda dentro das Myrtales. Análises de sintenia apontaram que dois destes quatros eventos foram oriundos de WGD. Em adição, a análise de elementos cis-regulatórios, nas Myrtales, mostrou enriquecimento em famílias de fatores de transcrição comumente envolvidas na resposta ao estresse, como MYB, ERF e bZIP. No terceiro capítulo exploramos o eixo regulatório, através do estudo dos fatores de transcrição MYB em Eugenia uniflora, uma espécie de Myrtaceae que possui um único gene P5CS. Essa espécie é amplamente distribuída e ocorre em diversas condições ambientais, como restingas e matas ciliares. Foram identificados 147 genes MYB no genoma de E. uniflora, dos quais 50 se mostraram diferencialmente expressos em condições de estresse hídrico. Posteriormente identificamos os potenciais genes EunMYB que atuam na regulação do P5CS em E. uniflora, integrando dados da literatura com aspectos evolutivos e transcriptômicos. Em conjunto, essa tese sintetiza aspectos estruturais, evolutivos e regulatórios envolvendo o gene P5CS, mostrando que uma abordagem ampla é essencial para a compreensão da evolução e diversificação dos genes.