Construção de vetores para geração de cepas de leveduras capazes de degradar glúten por meio de técnicas de optogenética

Abstract

A doença celíaca é um grande problema de saúde mundial, demandando todo um mercado de alimentos e produtos livres de glúten. Muitas vezes produtos possuem métodos de produção totalmente diferentes de suas versões convencionais, exigindo o uso de grãos que naturalmente não contenham glúten ou processos livres de glúten. A cerveja, sendo um produto oriundo da fermentação de mosto de malte de cevada, possui altos níveis de glúten, o que impede seu consumo por pessoas portadoras de doença celíaca. Com este trabalho, busca-se construir vetores epissomais para gerar cepas de leveduras capazes de degradar glúten, por meio da expressão de prolil endopeptidases (PEPs) bacterianas, utilizando técnicas de optogenética. Foi realizado uma série de prospecções por meio de ferramentas de bioinformática para selecionar possíveis PEPs tendo como base a sequência da PEP de Chryseobacterium taeanense que sabidamente degrada glúten. Para o controle da expressão gênica serão utilizados interruptores optogenéticos que se baseiam na mudança conformacional de fotorreceptores permitindo uma alta capacidade de expressão de genes heterólogos e controle espaço-temporal. Para tanto, foram gerados três vetores epissomais denominados pUFRGS: dois com diferentes marcas de seleção que promovem prototrofia de aminoácidos e um com resistência à canamicina. A construção desses vetores foi realizada empregando diferentes técnicas de biologia sintética para a concatenação dos componentes que incluem uma marca de seleção de transformantes, um aparato de expressão heteróloga, um sítio múltiplo de clonagem e origens de replicação bacteriana e de leveduras. Com esses vetores foi possível expressar um marcador denominado GFP split em uma cepa híbrida de levedura mostrando não apenas sua funcionalidade como a possibilidade de expressar genes divididos. Essa capacidade será fundamental para as futuras etapas deste trabalho.

Celiac disease is a significant global health issue, driving the demand for an entire market of gluten-free foods and products. Often, these products require completely different production methods than their conventional counterparts, requiring naturally gluten-free grains or gluten-free processing techniques. Beer, as a product derived from the fermentation of barley malt wort, contains high levels of gluten, making it unsuitable for consumption by individuals with celiac disease. Therefore, this study aims to develop episomal vectors to create yeast strains capable of degrading gluten by expressing bacterial prolyl endopeptidases (PEPs) using optogenetic techniques. A series of bioinformatics tools were used to identify potential PEPs based on the sequence of the Chryseobacterium taeanense PEP, known for its gluten-degrading properties. Optogenetic switches will be employed to control the gene expression, which rely on the conformational changes of photoreceptors, enabling a high expression capacity of heterologous genes with spatial and temporal control. To this end, three episomal vectors were constructed, named pUFRGS: two with different selection markers promoting amino acid prototrophy and one with kanamycin resistance. These vectors were assembled using various synthetic biology techniques to assemble these components, including a selectable marker for transformants, a heterologous expression apparatus, a multiple cloning site, and replication origins for both bacterial and yeast systems. Using these vectors, a split GFP marker was successfully expressed in a hybrid yeast strain, demonstrating its functionality and the feasibility of expressing split proteins. This capability will be crucial for future stages of this research.