Interações da α-sinucleína humana com vesículas extracelulares e ureases microbianas : efeitos dos agregados sobre a citotoxicidade observada in vitro

Abstract

O papel de microrganismos urease-positivos, como Proteus mirabilis e Helicobacter pylori, na progressão de doenças neurodegenerativas é pouco conhecido. Na Doença de Parkinson, corpos de Lewy, compostos de agregados de α-sinucleína (α-sin), levam à morte de neurônios dopaminérgicos na substância nigra pars compacta. Este estudo investigou a interação das ureases com a α-sin e a citotoxicidade dos agregados resultantes. A urease de P. mirabilis (PMU) foi purificada por cromatografias de gel filtração e troca iônica (Q Sepharose Fast Flow, Source 15QTM, e Superdex S200TM). A α- sin foi purificada por precipitação com HCl 9% e sulfato de amônio 50%, cromatografia em Source 15QTM. Nos ensaios de cinética de agregação, α-sin (50 ou 140 μM) foi incubada com PMU (6 nM) ou com vesículas extracelulares (OMVs) de H. pylori (Hp- OMVs, 50, 100 e 200 μg/mL) na presença de Thioflavina-T, sob agitação a 37 oC, por sete dias. O conteúdo de HPU das Hp-OMVs foi medido. Os agregados obtidos foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão. Para avaliar a toxicidade, culturas de micróglia murina BV-2 foram tratadas com os incubados de 0 ou 7 dias, PMU (252 pM), α-sin (5040 nM), PMU + α-sin, LPS + α-sin (controle positivo), analisando-se viabilidade, citotoxicidade e apoptose com o kit ApoTox-GloTM. A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) foi avaliada com a sonda CM-DFFDA, e a atividade metabólica celular, com o teste MTT. Os resultados mostraram que a PMU interferiu na oligomerização da α- sin, e que os agregados de α-sin formados na presença de PMU tem morfologias distintas. As Hp-OMVs não influenciaram a cinética da agregação ou a morfologia dos agregados de α-sin. Nos ensaios de toxicidade com o kit ApoTox-Glo, os incubados de 7 dias contendo α-sin sozinha, ou na presença de PMU e LPS, induziram um aparente aumento na viabilidade celular, sem alterações na citotoxicidade ou apoptose. Nas condições do ensaio, não houve aumento significativo na produção de EROs nas células tratadas. Já o teste MTT revelou que as células tratadas com os incubados de 7 dias tiveram importante redução na sobrevivência celular. Como conclusão, demonstramos que ocorre uma interação física entre PMU e a α-sin, impactando a cinética de agregação e a morfologia das fibrilas de α-sin. Estudos adicionais são necessários para esclarecer se as alterações induzidas por ureases na oligomerização e morfologia dos agregados de α-sin podem ter impacto nas alfa-sinucleinopatias, como a Doença de Parkinson.

The involvement of urease-positive microorganisms, such as Proteus mirabilis and Helicobacter pylori, on the progression of neurodegenerative diseases remains to be elucidated. In Parkinson’s Disease, Lewy bodies composed of aggregated α-sinuclein (α- sin) lead to the death of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta. This study investigated the interaction between ureases and α-sin and the cytotoxicity of the resulting aggregates. P. mirabilis urease (PMU) was purified by chromatographies on Q Sepharose Fast Flow, Source 15QTM, and Superdex S200TM columns, while α-sin was purified by precipitation with 9% HCl and 50% ammonium sulfate saturation, followed by Source 15QTM chromatography. In the aggregation kinetics experiments, α-sin (50 or 140 μM) was incubated with PMU (6 nM) or H. pylori extracellular vesicles (Hp-OMVs, 50, 100, and 200 μg/mL) in the presence of Thioflavin-T, under agitation at 37°C for seven days. HPU content in Hp-OMVs was measured. Aggregates obtained were vizualized by transmission electronic microscopy. To assess aggregates’ toxicity, murine microglia (BV- 2) cultures were treated with incubates of 0 or 7 days: PMU (252 pM), α-sin (5040 nM), PMU + α-sin, LPS + α-sin (positive control). Viability, cytotoxicity, and apoptosis were analyzed using the ApoTox-GloTM kit. Reactive oxygen species (ROS) production was evaluated using the CM-DFFDA probe, and cellular metabolic activity was measured with the MTT assay. Results indicated that PMU interfered on the oligomerization of α-sin and that α-sin aggregates formed in the presence of PMU showed distinct morphology. Under the tested conditions, Hp-OMVs did not interfere on the agregation kinetics or morphology of α-sin aggregates. In the toxicity assays with ApoTox-Glo kit, 7 days-incubates containing α-sin alone or in the presence of PMU or LPS induced an apparent increase in cell viability, with no changes in cytotoxicity or apoptosis of BV-2 cells. There was no significant increase of ROS production, while the MTT assay showed relevant reduction in the survival of cells treated with the 7 days incubates. As a conclusion, we demonstrated that a physical interaction occurs between PMU and α-sin, which interferes on the aggregation kinetics and morphology of α-sin fibrils. Additional studies are needed to elucidate whether the urease-induced alterations on the oligomerization and morphology of α-sin aggregates could have any impact on alpha-synucleinopathies, such as Parkinson’s Disease.