Investigação do efeito neuroprotetor da melatonina em modelo in vitro de toxicidade do peptídeo ß-amilóide

Abstract

O aumento da longevidade da população mundial tem como conseqüência uma maior prevalência de doenças neurodegenerativas. A Doença de Alzheimer (DA) é a desordem neurodegenerativa mais prevalente e a principal causa de demência após os 60 anos. A DA caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Esses sintomas são explicados por uma marcante perda neuronal e pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: os emaranhados neurofibrilares (NFTs) intracelulares constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas senis extracelulares constituídas pela proteína beta-amilóide (Aß). Estudos recentes têm evidenciado que um processo inflamatório crônico, desencadeado pelo acúmulo de Aß, possui um papel central no processo neurodegenerativo da DA. Alguns dos componentes característicos da neuroinflamação na DA são astrogliose, microgliose e elevação dos níveis de citocinas. Estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças do SNC têm sido amplamente pesquisadas. Dentre essas moléculas a melatonina tem demonstrado potencial atividade neuroprotetora, porém os mecanismos celulares e moleculares para esta atividade permanecem pouco conhecidos. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo investigar o efeito neuroprotetor da melatonina em modelo in vitro de toxicidade do Aß25-35. Para esse propósito foram utilizadas culturas de hipocampo de rato tratadas cronicamente com melatonina, nas concentrações de 25µM, 50µM ou 100µM, e expostas a 25µM do peptídeo Aß por 6h, 12h, 24h ou 48h.A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo (IP), um marcador de morte celular. Os resultados do presente estudo mostraram que o tratamento com melatonina nas concentrações de 50µM e 100µM preveniu a morte celular induzida pela exposição das culturas organotípicas de hipocampo de rato ao peptídeo Aß por 48h. A melatonina em todas as concentrações usadas nesse trabalho preveniu a hiperfosforilação da proteína tau induzida pela exposição por 48h ao peptídeo Aß. A ativação da GSK-3ß observada após 12h de exposição ao Aß25- 35 foi prevenida pelo pré-tratamento com 100µM de melatonina. Uma significante ativação glial foi observada após 48h de exposição das culturas organotípicas ao Aß, evidenciado através do aumento do imunoconteúdo da GFAP e da reatividade da Isolectina B4, enquanto que o tratamento com melatonina 100µM foi capaz de prevenir a ativação de astrócitos e microglia. Os níveis de TNF-a mostraram-se aumentados após 24h e 48h de exposição ao Aß e foi observada redução significativa desses nas culturas pré-tratadas com melatonina 100µM. Os níveis de IL-6 aumentaram apenas após 48h de exposição ao Aß25-35, sendo esse efeito prevenido pela melatonina na concentração de 100µM. O tratamento das culturas com melatonina por 14 dias antes da exposição ao peptídeo Aß25-35 apresentou efeito neuroprotetor no modelo in vitro de toxicidade ao peptídeo beta-amilóide. Embora mais estudos sejam necessários para compreensão do mecanismo neuroprotetor da melatonina nessa patogênese, os resultados desse trabalho sugerem que a melatonina possa exercer sua neuroproteção através da inibição da hiperfosforilação da proteína tau, diminuição da atividade da GSK-3ß, prevenção da ativação de astrócitos e da microglia e inibição da liberação dos mediadores pró-inflamatórios TNF-a e IL-6.

The increase of the average life expectancy of the world-wide population has been followed by increase in the prevalence of neurodegenerative diseases. Alzheimer's disease (AD) is the most prevalent age-related neurodegenerative disorder affecting people 60 years and older. The AD is characterized for an increasing decline in the mental function and memory of the patient. These symptoms are explained by a marked neuronal loss and the presence of structural alterations in the cerebral tissue: the intracellular neurofibrilary tangles (NFTs) of the hyperphosphorylated protein tau and extracellular amyloid-beta (Aß) into senile plaques. Recent evidence suggests that a chronic inflammatory process, triggered by Aß deposition, plays an important role in the pathogenesis of AD. Neuroinflammation associated with AD is characterized by astrogliosis, microgliosis and citokyne elevation. Therapeutic strategies for the treatment of CNS diseases have been widely researched. Substantial evidence indicates that melatonin has neuroprotective effects; however, the cellular and molecular mechanisms remain poorly informed. Therefore, the present work was designed to investigate the neuroprotective effects in an in vitro model of toxicity by Aß25-35. For this purpose, organotypic slice cultures of rat hippocampus were treated chronically with melatonin, 25µM, 50µM or 100µM, and then exposed to 25µM of Aß25-35 for 6h, 12h, 24h or 48h. Cell death was quantified by measuring propidium iodide (PI) uptake, a marker of necrotic dead cell. The results of the present study had shown that the pretreatment with melatonin, at concentrations of 50µM and 100µM, prevented cell damage in hippocampus induced by the exposure to 25µM of Aß25-35 for 48h. The treatment with melatonin in all the concentrations prevented the hyperphosphorylation of protein tau induced by 25µM of Aß25- 35 peptide. Melatonin also prevents GSK-3ß activation after 12h of Aß exposition. A marked glial activation was showed after exposure of hippocampal cultures to Aß25-35 for 48h, as evidenced by GFAP and Isolectin B4 increase in reactivity, and the treatment with 100µM of melatonin prevented the activation of astrocytes and microglia.The exposure to 25µM of Aß25-35 for 24h and 48h increased the TNF-α concentration in the medium and the pretreatment with 100µM of melatonin significantly reduced the levels of this cytokine after 48h of exposure to peptide. In addition, IL-6 levels increased only after 48h of exposition to Aß25-35 and the pretreatment with 100µM of melatonin also prevented this increase. The treatment of cultures with melatonin for 14 days before the peptide exposure exercised neuroprotective effects in the in vitro model of toxicity by Aß25-35. Although further studies are necessary for understanding the neuroprotective mechanisms in AD, the data suggests that the melatonin could to exert neuroprotection through the inhibition of tau hyperphosphorylation, reduction of GSK-3ß activity, prevent microglial and astroglial activation and reduce the release of pro-inflammatory factors, as TNF-a and IL-6.