UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE - ICBS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: FISIOLOGIA

FRANCIELLI LICKS

AÇÃO DA N-ACETILCISTEÍNA (NAC) NA GASTROPATIA DA HIPERTENSÃO PORTAL

Porto Alegre 2013

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FRANCIELLI LICKS

AÇÃO DA N-ACETILCISTEÍNA (NAC) NA GASTROPATIA DA HIPERTENSÃO PORTAL

Orientadora: Profa. Dra. Norma Anair Possa Marroni

Dissertação apresentada como requisito para a obtenção do grau de Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Porto Alegre 2013

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“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original”.

Albert Einstein

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Dedico este trabalho Aos meus pais, pelo apoio e incentivo constantes que sempre me fortaleceram; Ao meu irmão e irmã, pelo carinho e compreensão em momentos de ausência; À minha orientadora, cujas mãos me guiaram por toda essa caminhada.

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AGRADECIMENTOS

O sucesso deste trabalho é fruto da união de muitas forças. Por isso, agradeço as muitas pessoas que me auxiliaram no desenvolvimento dessa dissertação, as quais presto singela homenagem neste momento. Primeiramente agradeço aos meus pais, por terem consolidado em mim a importância e o valor do estudo. Agradeço também por todos os momentos em que me apoiaram, que torceram por mim e me amaram de maneira incondicional. Mãe e Pai, obrigada por serem as pessoas lindas que são, eu amo vocês. Agradeço também aos meus irmãos Irineu e Dhiovanna, pela compreensão e carinho. Irineu, meu mano, que participou desde o início dessa caminhada, tenha certeza que grande parte do meu sucesso eu devo a você. Obrigada por ser muito mais que meu irmão e sim meu amigo, confidente e parceiro de todas as horas. E Didi, minha pequena, você faz a minha vida mais feliz! Obrigada pelos sorrisos, abraços e amor mais que sincero. Á professora Drª Norma Marroni, uma pessoa que muito admiro, que me acolheu desde a minha graduação, e me educou durante todos esses anos para que eu fosse hoje a pessoa e profissional que sou. Obrigada por tudo. Agradeço também ao Dr. Cláudio Marroni, pelo auxílio na execução deste projeto e inúmeras correções e orientações. Aos todos os colegas do grupo de pesquisa do Laboratório de Hepatologia e Gastroenterologia Experimental / Laboratório de Estresse Oxidativo e Antioxidantes, Graziela, Éder, Darlan, e todos os outros integrantes do grupo, pelo apoio na execução deste trabalho. Cada um de vocês teve participação imprescindível no desenvolvimento deste projeto, e a todos meu sincero muito obrigada. Em especial agradeço a Renata Hartmann, pela cumplicidade e parceria sempre presentes. Ao longo desse tempo você se tornou não só uma colega, mas também uma grande amiga. Também ás colegas da ULBRA, sempre me ajudando e estimulando, Josiele, Elizângela e Tatiele, obrigada por tudo, por estarem presentes nos altos e baixos, sempre ao meu lado. Á minha querida Silvia, também agradeço por tudo, você é uma

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pessoa muito especial. Obrigada por todas as vezes que você me ajudou e apoiou, durante todo esse período. Agradeço também á Camila que, mesmo de longe, acompanhou todo o meu desenvolvimento, me incentivando e ajudando de inúmeras formas. Agradeço aos professores do nosso grupo de pesquisa, em especial ao Dr. Henrique Fillmann, por ter me auxiliado sempre, durante todo esse período. Muito obrigada de coração pela disponibilidade e apoio. Também á Drª Marilene Porawski, Dr. Alexandre Simões Dias e Drª. Maria Isabel Morgan Martins pelo constante auxílio e incentivo. Agradeço aos colegas e professores do programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - Fisiologia, pelas oportunidades de aprendizagem a mim proporcionadas nesses últimos dois anos. Por fim agradeço a Deus por ter colocado na minha caminhada, pessoas tão importantes e especiais. E também por não ter saído do meu lado, nem por um só segundo, durante toda a minha vida.

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RESUMO

A

Hipertensão

Portal

(HP)

é

uma

síndrome

clínica

associada

ao

desenvolvimento de circulação hiperdinâmica e varizes gastroesofágicas. O objetivo deste estudo foi avaliar a ação antioxidante da N-Acetilcisteína (NAC) em ratos com hipertensão portal. MATERIAIS E MÉTODOS: A HP foi induzida por meio do modelo experimental de ligadura parcial da veia porta (LPVP) e os animais divididos em quatro grupos experimentais (n=6): Sham-operated (SO), SO + NAC, LPVP e LPVP + NAC. A NAC (10 mg/kg ip.) foi administrada diariamente durante 7 dias, iniciados no 8º dia após a cirurgia. Foi mensurada a pressão portal na veia mesentérica, e o dano hepático foi avaliado através das enzimas AST, ALT e FA. Para avaliação do dano oxidativo no estômago, foi feita a avaliação da lipoperoxidação através da técnica das substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e avaliadas as atividades das enzimas antioxidantes SOD e GPx. Também foram avaliados os níveis de metabólitos do óxido nítrico (nitritos e nitratos), e, para avaliação dos aspectos histológicos, mensuramos os calibres dos vasos na submucosa gástrica, bem como analisamos lâminas coradas com hematoxilina-eosina. RESULTADOS: Os animais do grupo LPVP apresentaram um aumento significativo nos valores de pressão portal, TBARS e metabólitos do óxido nítrico quando comparados ao grupo SO. Esses valores foram acompanhados por uma diminuição das enzimas antioxidantes SOD e GPx. Na análise histológica, notaram-se vasos dilatados e presença de edema na mucosa gástrica dos animais do grupo LPVP. O tratamento com a NAC foi capaz de diminuir os valores da pressão portal, TBARS e metabólitos do óxido nítrico quando comparados ao grupo LPVP. Além disso, foi observado um aumento na atividade das enzimas

antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx). Na avaliação da histologia do estômago, a NAC atenuou o edema e vasodilatação nos animais do grupo LPVP +NAC. Não houve diferença estatística significativa entre os valores das enzimas hepáticas. CONCLUSÕES: Sugerimos que a administração da N-acetilcisteína em ratos com hipertensão portal é eficaz na

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redução ao dano gástrico infligido pelo modelo experimental de ligadura parcial da veia porta. Palavres-chave: Hipertensão portal, Estresse oxidativo, N-acetilcisteína

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ABSTRACT

Portal Hypertension (PH) is a clinical syndrome associated with the development of a hyperdynamic circulation and gastroesophageal varices. The aim of this study was to evaluate the antioxidant effect of N-Acetylcysteine (NAC) on portal hypertensive rats. MATERIAL/METHODS: PH was induced by partial portal vein ligature (PPVL), and the animals were divided into four experimental groups (n = 6): Sham-operated (SO), SO + NAC, PPVL and PPVL + NAC. NAC (10 mg / kg ip.) was administered for 7 days daily, beginning on the 8th day after surgery. Portal pressure was measured in mesenteric vein and liver damage was assessed by the enzymes AST, ALT and FA. To assess oxidative damage in the stomach, the technique of substances that react to thiobarbituric acid (TBARS) was performed and the activities of antioxidant enzymes dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx) was evaluated. The nitric oxide metabolites levels (nitrites and nitrates) were also evaluated and histological evaluation was made by measuring the vessels sizes in the gastric submucosa and blades stained with hematoxylin-eosin were analyzed. RESULTS: PPVL animals showed a significant increase in portal pressure, TBARS and nitric oxide metabolites values when compared to the SO group. These values were accompanied by a decrease of antioxidant enzymes SOD and GPx. In histological analysis, dilated vessels and edema in gastric mucosa of PPVL group were noted. Treatment with NAC was able to decrease portal pressure, TBARS and nitric oxide metabolites values when compared to PPVL. Furthermore, an increase in antioxidant enzymes SOD and GPx activity was observed. In the assessment of stomach histology, NAC attenuated the vasodilation and edema in PPVL + NAC group. There was no statistically significant difference between the values of liver enzymes. CONCLUSIONS: We suggest that N-acetylcysteine administration in rats with portal

hypertension is effective in reducing gastric damage inflicted by the experimental model of partial portal vein ligation. Keywords: Portal hypertension, Oxidative stress, N-Acetylcysteine

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Desenho que evidencia o sistema venoso portal. ............................. 17 Figura 2: Esquema que mostra as causas da hipertensão portal. .................... 19 Figura 3: Fotografia da região abdominal mostrando os colaterais

portossistêmicos, apontados pela flecha. ......................................................... 20 Figura 4: Desenho que evidencia as varizes gástricas (VG) e esofágicas (VE)20 Figura 5: Endoscopia da mucosa gástrica demonstrando um quadro de gastropatia moderada (A) e grave (B). ............................................................. 22 Figura 6: Cascata de reações que mostra a formação de espécies reativas de oxigênio e radicais livres. ................................................................................. 24 Figura 7: Reação que mostra a formação do NO. ............................................ 25 Figura 8: Esquema que mostra as isoformas da NO-sintase. .......................... 26 Figura 9: Fórmula química da N-acetilcisteína. ................................................ 31 Figura 10: Modelo de ligadura parcial da veia porta. ........................................ 38 Figura 11: Incisão na região abdominal do rato onde se observa a veia porta, apontada pela flecha. ....................................................................................... 39 Figura 12: Região abdominal do rato com isolamento da veia porta, apontado pela flecha. ....................................................................................................... 39 Figura 13: Região abdominal do rato mostrando a ligadura parcial da veia porta, apontada pela flecha .............................................................................. 40 Figura 14: Procedimento de administração da N-acetilcisteína........................ 40 Figura 15: Polígrafo para registro da pressão da marca Lettica (Rochester, MI, USA). ................................................................................................................ 42 Figura 16: Efeito da administração da N-acetilcisteína (NAC) sobre os níveis de pressão portal nos grupos SO: Sham-operated, SO +NAC, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC. ............................................................... 49 Figura 17: Efeito da administração da N-acetilcisteína (NAC) sobre os níveis das enzimas hepáticas AST, ALT e FA nos grupos SO: Sham-operated, SO +NAC, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC.. ......................... 49

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Figura 18: Efeito da administração da N-acetilcisteína (NAC) sobre os níveis de TBARS nos grupos SO: Sham-operated, SO +NAC, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC. ................................................................................ 50 Figura 19: Efeito da administração da N-acetilcisteína (NAC) sobre os níveis de SOD nos grupos SO: Sham-operated, SO +NAC, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC. ................................................................................ 51 Figura 20: Efeito da administração da N-acetilcisteína (NAC) sobre os níveis de GPx nos grupos SO: Sham-operated, SO +NAC, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC. ................................................................................ 52 Figura 21: Efeito da administração da N-acetilcisteína (NAC) sobre os níveis de NO nos grupos SO: Sham-operated, SO +NAC, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC. ....................................................................................... 52 Figura 22: Fotomicrografia de estômago de animais dos grupos. .................... 53 Figura 23: Valores médios obtidos na mensuração do calibre dos vasos nos grupos SO: Sham-operated, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC. ................................................................................................................. 54

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LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ALT AST CAT CCl4 cNOS DNMA eEROS eNOS EPM FA G GHP GPx GR GSSG GST H2O H2O2 HCPA HP IL iNOS KCl Kg L LPO LPVP LPVP+NAC μl µm M mL mm MM mmHg N2O3 NAC NaCl Alanina-aminotransferase Aspartato-aminotransferase Catalase Tetracloreto de carbono Óxido nítrico sintase dependente de cálcio Dimetilnitrosamina Elétron Espécies reativas de oxigênio Óxido nítrico sintase endotelial Erro padrão da média Fosfatase alcalina Glandular Gastropatia da hipertensão portal Glutationa peroxidase Glutationa redutase Glutationa dissulfeto Glutationa s-transferase Água Peróxido de hidrogênio Hospital de Clínicas de Porto Alegre Hipertensão portal Interleucina Óxido nítrico sintase induzível Cloreto de Potássio Quilograma Litro Lipoperoxidação Ligadura parcial de veia porta Ligadura parcial de veia porta tratado com N-acetilcisteína Microlitro Micromolar Molar Mililitro Milímetro Muscular da mucosa Milímetros de mercúrio Trióxido de dinitrogênio N-acetilcisteína Solução fisiológica

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NADPH Nm Nmol NO2 NO NOS ‘O2 O2 O2 ._ OH ONOO PIH PMSF POD PP Rpm SM SO SO+NAC SOD TAA TBA TBARS TCA TIPS TNF-α TNBS VEGF

Fosfato nicotinamida adenina dinucleotídeo Nanômetro Nanomol Dióxido de nitrogênio Óxido nítrico Òxido nítrico sintase Oxigênio singlet Oxigênio Radical ânion superóxido Radical Hidroxil Peroxinitrito Provas de integridade hepática Fluoreto de fenilmetilsulfonilo Piruvato oxidase Pressão portal Rotação por minuto Submucosa Sham-operated - controle (simulação da cirurgia) Sham operated - controle tratado com N-acetilcisteína Superóxido Dismutase Tioacetamida Ácido tiobarbitúrico Substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico Ácido tricloroacético Anastomose portossistêmica intra-hepática transjugular Fator de necrose tumoral alfa Ácido trinitro benzenosulfônico Fator de crescimento vascular endotelial

13 SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ................................................................................................. 15 1 REFERENCIAL TEÓRICO............................................................................ 17 1.1 SISTEMA VENOSO PORTAL ................................................................ 17 1.2 HIPERTENSÃO PORTAL ....................................................................... 18 1.3 GASTROPATIA DA HIPERTENSÃO PORTAL ...................................... 21 1.4 ESTRESSE OXIDATIVO E NITROSATIVO ............................................ 23 1.4.1 Espécies reativas de oxigênio e radicais livres ................................ 23 1.4.2 Óxido nítrico ..................................................................................... 25 1.5 DEFESAS ANTIOXIDANTES ................................................................. 28 1.5.1 Antioxidantes enzimáticos ................................................................ 28 1.5.2 Antioxidantes não-enzimáticos ......................................................... 30 1.6 N-ACETILCISTEÍNA ............................................................................... 31 1.7 MODELOS EXPERIMENTAIS DE HIPERTENSÃO PORTAL ................ 32 2 OBJETIVOS DO ESTUDO ............................................................................ 35 2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................. 35 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................... 35 3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 36 3.1 DELINEAMENTO DA PESQUISA .......................................................... 36 3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ....................................................... 36 3.2.1 Animais ............................................................................................ 36 3.2.2 Considerações bioéticas .................................................................. 36 3.2.3 Grupos experimentais ...................................................................... 37 3.2.4 Procedimentos experimentais .......................................................... 38 3.2.4.1 Desenvolvimento do modelo de hipertensão portal pela ligadura parcial de veia porta .............................................................................. 38 3.2.4.2 Administração do veículo e da N-acetilcisteína ......................... 40 3.2.4.3 Aferição da pressão venosa portal, morte dos animais e obtenção das amostras de tecido e sangue .......................................... 41 3.3 AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS ................................................................ 43 3.3.1 Preparação do homogeneizado ....................................................... 43 3.3.2 Dosagem de proteína ....................................................................... 43 3.4 ANÁLISES DE ESTRESSE OXIDATIVO ................................................ 43 3.4.1 Determinação dos níveis de substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico .............................................................................................. 43 3.4.2 Atividade da enzima superóxido dismutase ..................................... 44 3.4.3 Atividade da enzima glutationa peroxidase ...................................... 45 3.5 MEDIDA DE NITRITOS E NITRATOS .................................................... 46 3.6 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DOS TECIDOS ............................... 47 3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ......................................................................... 47 4 RESULTADOS .............................................................................................. 48 4.1 VERIFICAÇÃO DA ALTERAÇÃO DA PRESSÃO PORTAL ................... 48 4.2 PROVAS DE INTEGRIDADE HEPÁTICA ............................................... 49

14

4.3 AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE SUBSTÂNCIAS QUE REAGEM AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO ........................................................................... 50 4.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA ANTIOXIDANTE SUPERÓXIDO DISMUTASE ........................................................................ 50 4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA ANTIOXIDANTE GLUTATIONA PEROXIDASE ...................................................................... 51 4.6 AVALIAÇÃO DOS METABÓLITOS DO NO ............................................ 52 4.7 DETERMINAÇÃO DOS ASPECTOS HISTOLÓGICOS PELA COLORAÇÃO DE HEMATOXILINA E EOSINA ........................................... 53 5 DISCUSSÃO ................................................................................................. 55 6 CONCLUSÕES ............................................................................................. 64 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 66 ANEXOS .......................................................................................................... 75 ANEXO A - Artigo redigido com os resultados da presente dissertação....... 76

INTRODUÇÃO

A hipertensão portal (HP) é resultante do aumento patológico da pressão portal com consequente desenvolvimento de vasos colaterais que redistribuem o fluxo sanguíneo do sistema porta para a grande circulação
[1]

.

A dilatação dos vasos, principalmente no estômago e esôfago, leva a um quadro de gastropatia da hipertensão portal (GHP), que se caracteriza pela vasodilatação na submucosa gástrica. Essas alterações hemodinâmicas
[2]

desencadeiam sangramento digestivo em 80-90% dos pacientes

, devido à

progressiva dilatação dos vasos que se rompem e levam à hemorragia [1]. O modelo de ligadura parcial da veia porta (LPVP) é o mais utilizado para estudar a patofisiologia da hipertensão portal pré-hepática. Esse modelo foi desenvolvido por Sikuller em 1985
[3]

, e diversos estudos experimentais

demonstraram que, em animais, a LPVP manifesta anormalidades gástricas equivalentes à GHP em humanos. Uma semana após o procedimento cirúrgico, os animais operados já estabelecem o quadro de GHP, sendo que aproximadamente 100% destes apresentam shunting portossistêmico e circulação colateral hiperdinâmica inclusive desenvolvidos em
[4]

. Nesse contexto, inúmeros trabalhos, laboratório,
[43,68]

nosso

utilizam

esse

modelo

experimental para estudar a hipertensão portal

.

O estresse oxidativo é apontado como fator desencadeante para a progressão de diferentes doenças. Na hipertensão portal, está relacionado à evolução da circulação colateral
[5]

, cujo desenvolvimento é associado à

superprodução de óxido nítrico (NO). Recentemente, níveis plasmáticos de NO foram encontrados em pacientes com gastropatia da hipertensão portal, estando, assim, este radical livre implicado na patogênese da GHP
[6]

. A

síntese demasiada de NO induz à formação de peroxinitrito (•ONOO) através da reação com espécies reativas de oxigênio, como o ânion superóxido, aumentando, dessa forma, o dano oxidativo na mucosa gástrica
[8] [7].

O uso da terapia antioxidante pode minimizar as consequências do estresse oxidativo na hipertensão portal . A N-acetilcisteína (NAC) é um

Introdução

16

antioxidante confiável, acessível e bem tolerado, amplamente utilizado na clínica, possuindo um mecanismo bastante estudado. A NAC é um scavenger de radicais livres capaz de elevar os níveis de glutationa, importante antioxidante endógeno do nosso organismo. Ainda, o componente tiol da NAC pode ligar-se ao óxido nítrico formando nitrotiol, diminuindo, assim, a biodisponibilidade de NO [9]. Desta forma, o objetivo primordial deste estudo foi avaliar a ação antioxidante da N-Acetilcisteína por meio da avaliação do dano hepático, da lipoperoxidação na mucosa gástrica através dos níveis de substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx), a mensuração dos metabólitos do óxido nítrico (nitritos e nitratos) e a análise histológica.

1 REFERENCIAL TEÓRICO

1.1 SISTEMA VENOSO PORTAL

O sistema venoso portal é constituído por veias responsáveis pelo transporte do sangue da região intra-abdominal do tubo digestivo, baço, pâncreas e vesícula biliar em direção ao fígado
[11]

. O vaso que conduz o

sangue proveniente dessas regiões é a veia porta, formada anatomicamente pela união da veia mesentérica superior e esplênica
[13]

.

No hilo hepático, a veia porta divide-se em dois ramos: direito e esquerdo. O ramo direito promove o aporte sanguíneo para o lobo direito do fígado, e o ramo esquerdo supre de sangue os lobos esquerdo, caudado e quadrado. As veias esplênicas se unem com as gástricas curtas formando a esplênica principal, que recebe sangue da veia gastroepiplóica esquerda e de vasos que drenam o pâncreas. A mesentérica inferior drena o sangue do cólon esquerdo e reto, unindo-se posteriormente à veia esplênica. A veia gástrica esquerda une-se à veia porta, e a mesentérica superior é formada por vasos que drenam o lado direito do cólon, intestino delgado e cabeça do pâncreas
[11]

.

Figura 1: Desenho que evidencia o sistema venoso portal. Fonte: adaptada [83].

1 Referencial teórico

18

A organização desse sistema permite que todo o sangue venoso, drenado do trato gastrointestinal, passe pelo território hepático antes de atingir a circulação sistêmica. O sangue portal é levado pelos ramos terminais da veia porta até os sinusóides e, desses, para as veias centrolobulares, que drenam para as veias hepáticas e essas, por sua vez, para a veia cava inferior, desembocando na aurícula direita e, após, na grande circulação [12]. O fluxo venoso no sistema porta é caracterizado por uma baixa resistência, alto fluxo e baixa pressão, sendo essa oscilante entre 5-10 mmHg em adultos, dependendo do método de mensuração empregado Qualquer alteração homeostática nesse sistema,
[11]

.

desencadeada

principalmente em virtude de uma obstrução ao fluxo sanguíneo, acarretará no aumento de pressão no sistema portal, levando a graves consequências e ao quadro denominado de hipertensão portal
[1]

.

1.2 HIPERTENSÃO PORTAL

A Hipertensão Portal é uma síndrome hemodinâmica caracterizada pelo aumento do gradiente de pressão portal, definido pela diferença de pressão entre a veia porta e a veia cava inferior
[10]

.

A hemodinâmica da circulação sanguínea é definida por meio de uma relação física que estabelece o conceito de fluxo (Q), a Lei de Ohm. Essa relação estabelece que o fluxo ao longo de um vaso é determinado por dois fatores: 1- O gradiente de pressão entre as extremidades deste vaso (∆P). 2- A resistência vascular oponente ao fluxo (R).

Dessa forma, o gradiente de pressão portal pode ser matematicamente definido da seguinte maneira: ∆P = Q X R. A pressão portal pode aumentar se houver aumento do fluxo sanguíneo portal ou aumento da resistência vascular, ou ambos
[11]

.

1 Referencial teórico

19

O aumento da resistência vascular é o mecanismo inicial na gênese da hipertensão portal. Essa elevação é desencadeada devido ao surgimento de um obstáculo anatômico qu pode ocorrer em qualquer nível do sistema venoso portal
[13]

.

De acordo com a localização desse obstáculo, as causas podem ser classificadas em pré-hepática (trombose da veia porta ou esplênica); intrahepática (cirrose) e pós-hepática (síndrome de Budd-Chiari) [13].

Figura 2: Esquema que mostra as causas da hipertensão portal. Fonte: adaptada [11].

A causa mais frequente para o desenvolvimento da hipertensão portal é a cirrose, doença em que o aumento da resistência é principalmente causado pela distorção da arquitetura hepática, através da fibrose e nódulos regenerativos [13]. Em uma situação fisiológica, a pressão no sistema portal gira em torno de 5-10 mmHg. Quando é observado um aumento persistente desse valor, considera-se esta situação característica de um quadro de hipertensão portal
[11]

. O aumento progressivo da pressão no sistema porta leva à dilatação dos

vasos, com consequente formação de colaterais portossistêmicos, que desviam o sangue proveniente do sistema portal diretamente para a circulação sistêmica, contornando o fígado
[10]

. Nesse contexto, ocorre angiogênese, bem

1 Referencial teórico

20

como dilatação de colaterais pré-existentes, no intuito de acomodar o volume sanguíneo esplâncnico [12].

Figura 3: Fotografia da região abdominal portossistêmicos, apontados pela flecha. Fonte: adaptada [18].

mostrando

os

colaterais

As complicações clínicas da HP estão relacionadas principalmente à formação desses vasos colaterais e a circulação hiperdinâmica. O surgimento de varizes pode ocorrer em qualquer segmento do tubo digestivo, sendo as mais importantes aquelas localizadas no estômago e esôfago, que se desenvolvem desde o fundo gástrico até o terço superior do esôfago
[12]

.

Figura 4: Desenho que evidencia as varizes gástricas (VG) e esofágicas (VE) Fonte: adaptada [19].

1 Referencial teórico

21

Episódios

hemorrágicos

decorrentes

da

ruptura

desses

vasos

representam uma das mais temidas consequências da doença, porém, não são as únicas de um quadro de HP, destacando-se a ascite, a encefalopatia hepática e a síndrome hepatorrenal
[12]

.

1.3 GASTROPATIA DA HIPERTENSÃO PORTAL

A

Gastropatia

da

Hipertensão

Portal
[12]

(GHP)

é

frequentemente

diagnosticada em pacientes com HP, independente de fatores como sexo, idade e grau de comprometimento hepático .

Uma grande variedade de termos, dentre eles gastrite erosiva, erosões gástricas agudas e ectasia vascular, foram utilizados para descrever o quadro de lesões gástricas frequente em 20 - 80% dos pacientes diagnosticados com hipertensão portal
[16]

. No entanto, atualmente, a terminologia característica

utilizada é gastropatia da hipertensão portal (GHP), que define as alterações da mucosa gástrica evidenciadas na endoscopia de pacientes com hipertensão portal. Essas alterações são principalmente representadas pelo surgimento de varizes no estômago desses pacientes
[14]

.

A GHP é tipicamente localizada no fundo gástrico e na parte superior do corpo do estômago, entretanto, pode afetar toda a área estomacal inclusive outras áreas do trato gastrintestinal
[16]

. A intensidade do quadro pode ser

classificada em moderada ou grave. No caso de moderada, a GHP compreende um quadro de padrão mosaico ou couro-de-cobra, enquanto a grave é caracterizada ainda por manchas avermelhadas (“red spots”) que podem ou não apresentar sangramento espontâneo (Figura 5) [14]. As alterações que dão origem à GHP são dependentes da dilatação dos vasos da mucosa e submucosa do estômago, bem como o aumento do fluxo sanguíneo nestes locais. Esses fatores são consequências do desenvolvimento da circulação hiperdinâmica característica da hipertensão portal. Até agora, inúmeros fatores vêm sendo investigados na tentativa de elucidar a patogênese da GHP, incluindo fatores humorais e distúrbios locais na regulação do tônus

A

B

1 Referencial teórico

22

vascular. Dessa forma, a gastropatia da hipertensão portal é classificada como uma desordem vascular
[14]

.

Figura 5: Endoscopia da mucosa gástrica demonstrando um quadro de gastropatia moderada (A) e grave (B). Fonte: adaptada [20,82].

Aproximadamente um terço dos pacientes com varizes esofágicas desenvolvem sangramento agudo, sendo que cada episódio de hemorragia está associado a um risco de mortalidade de cerca de 30%
[15]

. Os

sangramentos são desencadeados a partir de todos os eventos vasculares iniciados pelo aumento da pressão portal e progressiva dilatação dos vasos, fazendo com que ocorra ruptura e hemorragia [10]. A GHP é comumente observada em pacientes com hipertensão portal. No entanto, os mecanismos relacionados a tal doença não são facilmente compreendidos. O tratamento é geralmente focado na redução da pressão portal, medida cuja intenção é minimizar as uconsequências desencadeadas por este quadro [14]. O estresse oxidativo é associado e sugerido como um importante fator na progressão de diferentes doenças hepáticas, dentre elas a hipertensão portal. O potencial das espécies reativas de oxigênios (EROs) de se ligar a proteínas, quebrar DNA e promover dano celular através da reação com diferentes componentes celulares é o motivo pelo qual essas espécies são associadas a inúmeras desordens na clínica [8].

1 Referencial teórico

23

O papel do estresse oxidativo no desenvolvimento da circulação hiperdinâmica foi inicialmente proposto por Fernando et al.,1998
[17]

.

A

administração de N-acetilcisteína resultou em decréscimo da pressão portal, óxido nítrico, fator de necrose tumoral (TNF-α) e F2-Isoprostanos, resultados esses atribuídos à diminuição do fluxo sanguíneo no sistema portal. No entanto, os mecanismos através dos quais a terapia antioxidante foi capaz de minimizar os danos acarretados pelo modelo experimental de ligadura parcial da veia porta (LPVP) não foram totalmente elucidados.

1.4 ESTRESSE OXIDATIVO E NITROSATIVO 1.4.1 Espécies reativas de oxigênio e radicais livres

O oxigênio (O2) é um elemento essencial à vida aeróbica. No entanto, em determinadas situações, é também potencialmente tóxico para as células
[21]

. A molécula de oxigênio, em seu estado natural, é um birradical que

possui dois elétrons desemparelhados. Dessa forma, essa molécula é considerada um agente oxidante, capaz de oxidar outros átomos ou moléculas aceitando um par de elétrons. Esse processo de transferência de elétrons, ou a absorção de energia, pode gerar as espécies reativas de oxigênio (EROs) através de intermediários gerados durante o processo de redução parcial do oxigênio [22]. Nos organismos aeróbicos, o O2 é reduzido à água (H2O) no final da respiração mitocondrial. Durante esse processo, por receber apenas um elétron de cada vez, ocorre a redução parcial do O 2, gerando o radical ânion superóxido (O2°-). Ao se adicionar um hidrogênio ao ânion superóxido, este se reduz a peróxido de hidrogênio (H2O2). Se um terceiro elétron for acrescido, ocorrerá a formação de um radical hidroxil (OH °). Assim, a formação de espécies reativas de oxigênio deve-se ao fato de o O2 se reduzir à água de

1 Referencial teórico

24

forma monovalente, permitindo a geração de metabólitos intermediários durante o processo.

Figura 6: Cascata de reações que mostra a formação de espécies reativas de oxigênio e radicais livres. Fonte: adaptada [26]. Os intermediários gerados durante a redução parcial do oxigênio são o ânion superóxido (O2-), o peróxido de hidrogênio (H2O2), o “oxigênio singlet” (1O2) e o radical hidroxil (OH). Essas moléculas são capazes de existir independentemente, e são denominadas espécies reativas de oxigênio [23]. O termo radical livre é utilizado para definir uma espécie química, que pode ser um átomo, um metal de transição ou uma molécula que possua um elétron não pareado no seu último orbital. Esse elétron confere a essas moléculas uma alta reatividade, devido a sua tendência de adquirir um segundo elétron para esse orbital desestabilizado. A estabilização ocorre através da remoção de elétrons de moléculas vizinhas; dessa forma essas espécies possuem o poder de oxidar moléculas biológicas, como proteínas, lipídios, glicídios e ácidos nucléicos [24]. Podemos citar como radicais livres o radical hidroxila (OH ), o ânion radical superóxido (O2-) e o óxido nítrico (NO), que podem ser formados durante o metabolismo normal de qualquer célula pela perda de elétrons de um não-radical ou pelo ganho de um elétron por não-radical. Também podem ser formados quando uma ligação covalente é quebrada se cada um dos átomos ficar com um elétron, num processo conhecido como fissão homolítica
[25]

.

O estresse oxidativo é caracterizado por um aumento das espécies reativas de oxigênio (EROs) em relação aos seus níveis fisiológicos, levando a um desequilíbrio entre os agentes pró-oxidantes e antioxidantes
[24]

. Esse

desequilíbrio apresenta efeitos prejudiciais, tais como a peroxidação de lipídios

1 Referencial teórico

25

de membrana e agressão às proteínas dos tecidos e das membranas, às enzimas, carboidratos e DNA. Assim, está relacionado a várias doenças, como artrite, choque hemorrágico, doenças do coração, doenças do fígado, diabetes mellitus, catarata, disfunções cognitivas, câncer e AIDS, podendo ser a causa ou o fator agravante do quadro geral
[24]

.

Na hipertensão portal, o papel do estresse oxidativo no desenvolvimento da circulação hiperdinâmica foi proposto, inicialmente, por Fernando et al., 1998 que utilizaram o modelo experimental de ligadura parcial da veia porta
[29] [17]

.

Estudos anteriores demonstraram que o óxido nítrico parece exercer um papel importante na patogênese da hipertensão portal níveis do fator de necrose tumoral (TNF-α) dano oxidativo.
[28]

, bem como elevados

, ambos estando relacionados ao

1.4.2 Óxido nítrico

O óxido nítrico (NO) é uma molécula gasosa, altamente tóxica, habitualmente encontrada no ar atmosférico em pequenas quantidades. Tal toxicidade é associada à presença de sete elétrons de hidrogênio e oito de oxigênio, possuindo, dessa forma, um elétron desemparelhado, fato esse que o torna um agente químico extremamente reativo [31]. Essa molécula pode atuar como oxidante ou redutor, é rapidamente destruída pelo oxigênio, sendo que sua oxidação produz nitritos e nitratos
[33] [32],

e

também pode reagir facilmente com o radical superóxido ou metais como ferro, cobalto, manganês ou cobre .

A síntese do NO é catalisada pela enzima NO-sintase (NOS); para tanto, ocorre a oxidação de um dos dois nitrogênios guanidino da L-arginina, que é convertida em L-citrulina e óxido nítrico [35].

Figura 7: Reação que mostra a formação do NO. Fonte: adaptada [36].

1 Referencial teórico

26

Muitas isoformas de NOS já foram identificadas em diferentes tecidos, e diversas delas já tiveram seus genes clonados. Através da análise sequencial de aminoácidos, chegou-se à conclusão de que essas isoformas representam uma família de proteínas e, aparentemente, são produtos de três genes distintos. Dessa forma, são agrupadas em duas categorias: NOS constitutiva (c-NOS) e NOS induzível (i-NOS), diferindo em relação ao peso molecular, forma de ativação e capacidade de síntese de NO
[35]

.

Figura 8: Esquema que mostra as isoformas da NO-sintase. Fonte: adaptada [31].

Na categoria da NOS constitutiva, encontramos a NOS neuronal (nNOS), normalmente presente nos neurônios e a NOS endotelial (e-NOS), presente nas células endoteliais vasculares e nas plaquetas
[31]

. Ambas são

expressas continuamente na ausência de agentes indutores, ou seja, apresentam uma concentração basal e são dependentes de íons cálcio (Ca ++) e calmodulina [36]. No entanto, na categoria da NOS induzível, ao contrário da primeira, a iNOS não é detectada em condições basais, requerendo, para sua expressão e atividade, síntese protéica. Endotoxinas bacterianas, juntamente com citocinas como TNF-α, interleucinas (IL-1ß) ou imunoglobulinas (IG-g), induzem a sua síntese nas 2-4 primeiras horas após a exposição a um agente, e esta pode ficar ativa por até 20 horas posteriores a sua síntese [36]. Quanto à ação de cada uma das NOS, sabe-se que a eNOS favorece a diminuição da pressão sanguínea e auxilia na inibição da agregação

1 Referencial teórico

27

plaquetária; a nNOS regula a transmissão neuronal e responde por funções de um neurotransmissor; e as iNOS formam NO induzido por certas citotoxinas, estando intimamente relacionada aos processos de defesa do organismo
[34]

.

O óxido nítrico é considerado essencial para a homeostase vascular e prevenção de doenças cardiovasculares. Da mesma forma, é o principal mediador citotóxico de células imunes, e tem papel mensageiro/modulador em diversos importantes processos biológicos. No entanto, como
[31]

dito

anteriormente, o NO é altamente tóxico, sendo essa toxicidade proeminente em situações de estresse oxidativo e na deficiência do sistema antioxidante .

Os efeitos fisiológicos e fisiopatológicos das isoformas do óxido nítrico estão relacionados aos seus níveis de concentração. Quando atuam em

baixas concentrações, comportam-se como mensageiro e fator de proteção celular (antioxidante), interagindo com metais de transição e outros radicais livres. Em concentrações altas, e formando trióxido de dinitrogênio (N2O3) ou peroxinitrito (ONOO), o NO passa a agir como espécie ativa de nitrogênio, responsável por inúmeras ações citotóxicas em um quadro conhecido como estresse nitrosativo [22,34]. A hipertensão portal já foi previamente associada ao estresse oxidativo e à super-produção de óxido nítrico, ambos possuindo um importante papel nesse distúrbio hemodinâmico
[37]

.
[38]

Kanwar et al.,1996 demonstraram um aumento na atividade da NOS dependente de cálcio após estenose da veia porta . Muitos fatores, incluindo

o estresse de cisalhamento, vasopressina, angiotensina II e norepinefrina, podem elevar a forma constitutiva da NOS, e todos esses fatores estão aumentados na hipertensão portal
[39]

. Dessa forma, observamos na HP uma

alta concentração de óxido nítrico, estando esse aumento intimamente relacionado com o desenvolvimento da circulação hiperdinâmica e estresse oxidativo [40].

1 Referencial teórico

28

1.5 DEFESAS ANTIOXIDANTES

A fim de se proteger contra os danos acarretados pelo estresse oxidativo, necessitamos de um sistema capaz de prevenir a formação de radicais livres e neutralizar os danos oxidativos, o que é feito através dos antioxidantes, que podem ser definidos como qualquer substância que, quando presente em baixas concentrações – comparadas àquelas de um substrato oxidável (macromoléculas como proteínas, lipídios, hidrato de carbono e DNA) – atrasa ou impede a oxidação daquele substrato
[41]

. Dentre esses sistemas de

defesa, encontramos o enzimático, formado por enzimas como a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e glutationa s-transferase (GST), e/ou não enzimático, como o ácido ascórbico (vitamina C), α-tocoferol (vitamina E), flavonóides e ßcarotenos [24]. 1.5.1 Antioxidantes enzimáticos

Os antioxidantes enzimáticos compreendem agentes que cataliticamente removem os radicais livres e outras espécies ativas. Dentre essas enzimas, podemos destacar a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) [22]. A SOD atua na dismutação do ânion superóxido (O2-) em H2O2 e O2, sendo que o primeiro é menos reativo, e pode ser degradado por outras enzimas (equação 1) [42].

(equação 1)

O H2O2 formado pela ação da enzima SOD, apesar de não ser um radical, facilmente reage, originando radical hidroxila. Assim, a remoção dos peróxidos ocorre por meio das enzimas CAT e da GPx, tendo a CAT mais

1 Referencial teórico

29

afinidade ao peróxido de hidrogênio, de metila e etila, enquanto a GPx catalisa a redução do peróxido de hidrogênio e de hidroperóxidos orgânicos
[41]

.

A ação da CAT, que é bastante específica, pode ser observada na equação 2, na qual essa enzima catalisa a dismutação do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio [41].

(equação 2)

Entre as peroxidases, destaca-se a enzima glutationa peroxidase (GPX), localizada no citosol e na matriz mitocondrial. Esta enzima catalisa a redução do peróxido de hidrogênio e de hidroperóxidos orgânicos através da oxidação da glutationa reduzida (GSH), que será, por sua vez, regenerada por ação da glutationa redutase com consumo de fosfato nicotinamida adenina

dinucleotídeo (NADPH). Neste processo de oxirredução, os grupamentos sulfidrilas doam dois hidrogênios para os peróxidos, transformando-os em álcool e/ou água, formando glutationa dissulfeto (GSSG)
[24]

(equação 3).

(equação 3)

Assim como as enzimas que atuam removendo os radicais livres, existem substâncias com propriedades antioxidantes, capazes de evitar reações oxidativas em cadeia, como a lipoperoxidação (LPO), conhecidas como defesas antioxidantes não-enzimáticas, sendo as mais conhecidas a glutationa, o ácido ascórbico (vitamina C), o -tocoferol (vitamina E), os carotenos e os flavonóides. [43-46]

1 Referencial teórico

30

1.5.2 Antioxidantes não-enzimáticos

Dentre as substâncias antioxidantes não enzimáticas,

podemos

comentar algumas que se destacam. A glutationa participa de reações de enzimas antioxidantes tais como a glutationa peroxidase e a transferase. Dessa forma, uma alta concentração de GSH intracelular protege a célula contra a ação de espécies reativas de oxigênio, através de uma via não enzimática. A glutationa é um tripeptídeo de ácido α-glutamínico, cisteína e glicina, cuja ação deve-se à presença de um grupamento sulfidrila, que atua como doador de elétrons [47]. O ácido ascórbico (vitamina C) é um composto hidrossolúvel que atua como cossubstrato na biossíntese de colágeno, catecolaminas e carnitina. Este composto atua como scavenger de O2°- e OH°-, ou seja, um antioxidante varredor de radicais livres [48]. O -tocoferol (vitamina E) possui a capacidade de neutralizar radicais, absorvendo a sua energia de excitação. A vitamina E age principalmente com o oxigênio singlet, em concentrações baixas e com alta afinidade à luz
[49]

.

Os flavonóides são fitoterápicos descritos como antioxidantes, presentes nas folhas e partes externas das plantas. Muitos desses compostos estão sendo estudados e vêm apresentando resultados bastante promissores. Nosso laboratório obteve dados importantes ao estudar, por exemplo, o flavonóide quercetina, em modelos experimentais de cirrose induzida por ligadura de ducto biliar
[44] [45]

e tetracloreto de carbono (CCl 4)
[46]

, bem como em modelo de

diabetes induzida por streptozotocina

.

O uso de substâncias antioxidantes na prevenção ou tratamento de diferentes doenças relacionadas ao estresse oxidativo parece ser uma alternativa viável na tentativa de minimizar ou reverter os danos. Uma das substâncias com tais propriedades, utilizada na clínica médica, é a Nacetilcisteína.

1 Referencial teórico

31

1.6 N-ACETILCISTEÍNA

A N-acetilcisteína (NAC) é um composto tiólico amplamente utilizado na clínica médica, contendo um grupo sulfidril formado pela seguinte fórmula química C5H9NO3S [50] (Figura 9).

Figura 9: Fórmula química da N-acetilcisteína. Fonte: adaptada [50].

Essa molécula é o derivado N-acetílico do aminoácido cisteína, parte da molécula tripeptídica da GSH, e é um dos principais contribuintes na redução de equivalentes na forma de grupos sulfidris precursor da GSH [52]. A ação da NAC na restauração dos níveis de GSH já é bem compreendida e considerada promissora como antioxidante, visto que a glutationa neutraliza espécies reativas de oxigênio e nitrogênio através de vias diretas e indiretas
[53] [51]

. A NAC é um importante

antioxidante, que entra na célula, e, no citoplasma, é convertido a L-cisteína,

. A neutralização ocorre através da remoção de espécies

reativas através da formação e separação de adutos, sendo essa catalisada pela glutationa peroxidase (GPx), em uma reação NADPH dependente. A glutationa oxidada resultante é, então, reduzida pela glutationa redutase para iniciar o ciclo novamente
[53]

.

Inicialmente, a NAC foi aplicada no tratamento de doenças congestivas e obstrutivas pulmonares associadas à hipersecreção. Vem sendo utilizada na

1 Referencial teórico
[55]

32

clínica como antídoto no caso de overdose por paracetamol cardiovasculares
[56]

, nas doenças
[57],

, na isquemia hepática seguida por reperfusão

no

câncer [58] e na psiquiatria [53]. Outras aplicações da NAC, apoiadas por evidências científicas, incluem a prevenção de doença obstrutiva pulmonar crônica, atenuação do vírus influenza, quando administrada antes da infecção, na fibrose pulmonar, na síndrome de ovários policísticos e como um adjunto na erradicação no Helicobacter pylori [59]. As aplicações clínicas da NAC provêm de sua habilidade de repor antioxidantes durante estresse, infecções, agressões tóxicas e condições inflamatórias. Dessa forma, o seu uso parece ser promitente em inúmeras doenças relacionadas a tais situações. Na hepatologia, o possível papel da terapia antioxidante na modulação do tônus do leito vascular tem sido estudado por diferentes autores
[17] [5,17]

. Na

hipertensão portal, o uso da N-acetilcisteína parece contribuir de forma positiva para a atenuação dos danos acarretados por tal doença . No entanto,

estudos posteriores são necessários na tentativa de elucidar o mecanismo de ação da NAC na HP, bem como seu papel antioxidante nesta doença. Tendo em vista tais considerações, propomo-nos a desenvolver o modelo experimental de hipertensão portal em ratos e utilizar a N-acetilcisteína como tratamento antioxidante, com o intuito de avaliar e esclarecer a possível proteção da mesma sobre a mucosa gástrica desses animais.

1.7 MODELOS EXPERIMENTAIS DE HIPERTENSÃO PORTAL

Para que possamos estudar as alterações hemodinâmicas típicas da hipertensão portal, bem como os mecanismos moleculares envolvidos nas anormalidades presentes nesta síndrome, é necessária a utilização de modelos animais, o que vêm permitindo o melhor entendimento da fisiopatologia desta doença.

1 Referencial teórico

33

Na literatura, encontramos descritos diferentes modelos experimentais para estudar a hipertensão portal, sendo que o critério de escolha na utilização de um modelo em particular dependerá dos objetivos específicos do estudo a ser promovido. Ratos e coelhos são as espécies mais utilizadas, porém, recentemente, a metodologia para estudo da hipertensão portal vem sendo implementada em camundongos, possibilitando o estudo em animais knock out e transgênicos
[84-86]

. Os modelos experimentais disponíveis, podem ser

classificados como pós-hepáticos, intra-hepáticos e pré-hepáticos Com relação ao modelo pós-hepático, o objetivo é reproduzir as características da síndrome de Budd-Chiari, em que são observados danos hepáticos consequência de uma obstrução venosa. A obstrução é promovida pela implantação da ameróide, dispositivo de aço inoxidável que permite uma lenta expansão em contato com o tecido molhado, nas veias hepáticas, induzindo uma progressiva oclusão do fluxo venoso hepático
[87]

.

Os modelos experimentais intra-hepáticos podem ser diferenciados em pré-sinusoidais, sinusoidais e pós-sinusoidais. Como pré-sinusoidais, podemos citar o modelo de infecção experimental por Schistosoma mansoni, em que uma injeção com a cercariae do parasita é aplicada diretamente na parede abdominal
[88,89]

. Como exemplo de sinusoidal, existem diferentes modelos de
[90,78]

cirrose descritos na literatura, como a ligadura de ducto biliar induzida por tetracloreto de carbono (CCl 4) dimetilnitrosamina (DNMA)
[94] [91,45]

, cirrose
[92,93]

, tiocetamida (TAA)

e

. Em modelo pós-sinusoidal, a administração de
[95]

monocrotalina por gavagem desencadeia oclusão venosa e consequente hiperbilirrubinemia, hepatomegalia e ascite .

O modelo pré-hepático mais amplamente utilizado é a ligadura parcial da veia porta (LPVP), sendo o modelo eleito para este presente trabalho. Neste modelo experimental, a veia porta é separada do tecido circulante após uma incisão abdominal mediana, e após uma ligadura neste vaso, promove uma estenose venosa. Convencionalmente, uma agulha 20G é utilizada (0,889 mm de diâmetro), no entanto, agulhas de maior ou menor calibre podem ser utilizadas, dependendo se o objetivo for uma maior ou menor estenose
[3]

.

1 Referencial teórico

34

Uma semana após a ligadura, os animais desenvolvem completa síndrome portal hipertensiva, apresentando circulação hiperdinâmica e shunting porta-sistêmico, sendo esse detectável dois dias após a cirurgia. No 4º dia, já ocorre vasodilatação mesentérica e aumento do débito cardíaco no 7º dia, o fluxo sanguíneo portal é divergido totalmente em colaterais
[3] [3,96]

e

.

Diferentes estudos já demonstraram que, em ratos, a LPVP demonstra todas as anormalidades presentes na vasculatura gástrica quando comparadas à gastropatia portal hipertensiva em humanos. Assim, estudos voltados à tentativa de encontrar uma alternativa terapêutica para o sangramento das varizes gástricas
[97,98]

vêm

sendo

desenvolvidos,

utilizando

esse

modelo

experimental

.
[43,68]

Nosso grupo de pesquisa já promoveu estudos anteriores utilizando o modelo de ligadura parcial da veia porta , sendo obtidos resultados

bastante favoráveis quando da utilização das drogas quercetina e glutamina. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho é estudar a ação da Nacetilcisteína na gastropatia da hipertensão portal induzida por LPVP.

2 OBJETIVOS DO ESTUDO

2.1 OBJETIVO GERAL

Este trabalho tem por objetivo geral avaliar o efeito da N-acetilcisteína na mucosa gástrica de ratos com ligadura parcial de veia porta, um modelo experimental de Hipertensão Portal (HP).

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Avaliar a pressão portal através da veia mesentérica dos animais dos diferentes grupos experimentais; 2. Avaliar as provas de função hepática por meio de medidas de concentração sérica das aminotransferases aspartato (AST) e alanina (ALT), e da fosfatase alcalina (FA) no sangue dos animais dos diferentes grupos experimentais; 3. Avaliar a lipoperoxidação, utilizando os métodos de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) no estômago dos animais dos diferentes grupos experimentais; 4. Avaliar as enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx) no estômago dos animais dos diferentes grupos experimentais; 5. Avaliar os metabólitos de óxido nítrico (nitritos e nitratos) no estômago dos animais dos diferentes grupos experimentais; 6. Avaliar as alterações histopatológicas no estômago dos animais dos diferentes grupos experimentais, bem como o calibre dos vasos na submucosa gástrica.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 DELINEAMENTO DA PESQUISA

Este estudo tem caráter experimental qualitativo e quantitativo e, para isso, foi realizada a indução da hipertensão portal, por meio do modelo experimental de ligadura parcial de veia porta (LPVP).

3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

3.2.1 Animais

Foram utilizados 24 ratos machos Wistar (n=6), pesando entre 200 e 300 gramas, provenientes do Biotério da Unidade de Experimentação Animal do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Durante o experimento, os animais foram mantidos neste local, em caixas plásticas individuais, de 47x34x18cm, forradas com maravalha, em ciclos de doze horas claro/escuro (luz das 7 às 19 horas) e temperatura de 22

 2 C. água e a ração da marca Nutripal (Moinhos Purina, Porto Alegre,
RS/Brasil), foram administradas ad libitum, diariamente . As caixas foram limpas de acordo com a rotina da Unidade de Experimentação Animal do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.

3.2.2 Considerações bioéticas

Todos os procedimentos realizados seguiram de acordo com as normas estabelecidas pela Comissão de Pesquisa e Ética em Saúde contidas na Pesquisa em Saúde e Direito dos Animais, de autoria do grupo de pesquisa e Pós-Graduação do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)
[30]

.

3 Materiais e métodos

37

O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, sendo solicitado fomento junto ao Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos do HCPA, com número de protocolo 110293. Para detectar uma diferença na magnitude de 1,5 desvio padrão (magnitude de efeito grande) mantendo-se um α=0,05 e ß=90%, foram calculados seis ratos por grupo, totalizando 24 ratos.

3.2.3 Grupos experimentais

O modelo utilizado para o desenvolvimento da hipertensão portal foi a ligadura parcial de veia porta (LPVP), e os animais foram divididos em quatro grupos com n de seis animais: I. Controle (SO - sham-operated) + Veículo (NaCl)- Grupo submetido à simulação da cirurgia, e administração de veículo por 7 dias; II. Controle (SO - sham-operated) + N-acetilcisteína (NAC) - Grupo submetido à simulação da cirurgia e tratamento com NAC por 7 dias; III. Hipertensão Portal (LPVP) + Veículo (NaCl) - Grupo submetido à cirurgia de ligadura parcial da veia porta e administração de veículo por 7 dias; IV. Hipertensão Portal (LPVP) + N-acetilcisteína (NAC) - Grupo submetido à cirurgia de ligadura parcial da veia porta e tratamento com NAC por 7 dias.

Após o procedimento cirúrgico, os animais foram mantidos, em gaiolas individuais devidamente identificadas, com água e ração ad libitum. Para cálculo de dose do anestésico, foram registrados seus pesos no início do experimento (momento da cirurgia) e no momento da morte,.

3 Materiais e métodos

38

3.2.4 Procedimentos experimentais

3.2.4.1 Desenvolvimento do modelo de hipertensão portal pela ligadura parcial de veia porta

Os animais foram anestesiados com cetamina 100mg/Kg e xilazina 50mg/Kg por via intraperitonial. Após uma incisão mediana no abdome (na linha alba), as alças intestinais foram retiradas delicadamente por sobre uma gaze umidificada com soro fisiológico, e a veia porta foi isolada. Uma agulha de 20G foi colocada sobre a veia porta e ambas amarradas em fio de seda 3.0. Após, a agulha foi retirada delicadamente, sendo necessário certificar-se da ocorrência de trombose da veia porta durante sua manipulação
[54]

.

Figura 10: Modelo de ligadura parcial da veia porta. Fonte: adaptada [54].

As alças intestinais foram colocadas no abdome e, com pontos contínuos, fechou-se o peritônio, infundindo-se anteriormente cerca de 10mL

3 Materiais e métodos

39

de solução fisiológica na cavidade abdominal. A parede exterior foi fechada com pontos isolados. Uma solução antiséptica foi aplicada no local e os animais foram colocados em gaiolas individuais até o dia dos experimentos. Os animais pertencentes do grupo controle (SO) sofreram o mesmo procedimento cirúrgico, não tendo, no entanto, a veia porta parcialmente ligada. Após a cirurgia, os animais foram mantidos em gaiolas individuais, devidamente supervisionados até o dia do experimento, quinze dias após a constrição parcial da veia porta ou da cirurgia fictícia.

Figura 11: Incisão na região abdominal do rato onde se observa a veia porta, apontada pela flecha. Fonte: autor.

Figura 12: Região abdominal do rato com isolamento da veia porta, apontado pela flecha. Fonte: autor.

3 Materiais e métodos

40

Figura 13: Região abdominal do rato mostrando a ligadura parcial da veia porta, apontada pela flecha Fonte: autor.

3.2.4.2 Administração do veículo e da N-acetilcisteína

O tratamento diário com a NAC iniciou-se a partir do 8º dia do procedimento cirúrgico por via intraperitoneal, na dose de 10 mg de Nacetilcisteína por Kg de peso do animal. Os animais controle receberam o veículo (solução fisiológica – NaCl 0,9%) no volume de 0,6 mL.

Figura 14: Procedimento de administração da N-acetilcisteína. Fonte: autor.

3 Materiais e métodos

41

3.2.4.3 Aferição da pressão venosa portal, morte dos animais e obtenção das amostras de tecido e sangue

Transcorridos quinze dias do desenvolvimento do modelo e sete dias de administração de NAC ou veículo, de acordo com os grupos, os animais foram novamente pesados e anestesiados com uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg/kg) e cloridrato de xilasina (10 mg/kg) por via intraperitoneal. Primeiramente, foi coletado sangue pela técnica da punção do plexo retro-orbital, com tubo microcapilar de vidro, e este material foi utilizado para realizar as provas de integridade hepática por meio das análises da aspartatoaminotransferase (AST), da alanina-aminotransferase (ALT) e da fosfatase alcalina (FA). Na determinação da AST e da ALT no plasma, foi utilizado o método enzimático comercial (Boehringer Mannheim, Alemanha). Assim, a atividade enzimática do AST e ALT foi obtida pela medição cinética a 567 nm. A AST catalisou a reação do α-cetoglutarato e do ácido alanina sulfínico a piruvato e glutamato. A ALT catalisou a reação do α-cetoglutarato e alanina a piruvato e glutamato. O piruvato se hidrolisou a acetilfosfato, após a ação do piruvato oxidase (POD), anidrase carbônica e peróxido de hidrogênio (H 2O2). Em presença de POD, o H2O2 oxidou a forma reduzida incolor do indicador à forma azul. Para determinação da atividade da FA no plasma, foi empregado o método enzimático automatizado. Para isto, utilizou-se como substrato o paranitrofenilfosfato mais água, que formou, para-nitrofenol, um composto intensamente amarelo, com um máximo de absorbância de 400 nm. Posteriormente, realizou-se tricotomia da região abdominal, seguida de uma laparotomia ventral média, para que as alças intestinais fossem expostas. A aferição da pressão portal foi realizada através de um cateter inserido na veia mesentérica, conectado a um polígrafo Lettica (Rochester, MI, USA) que registrou a pressão e expressou o valor aferido em mmHg.

3 Materiais e métodos

42

Figura 15: Polígrafo para registro da pressão da marca Lettica (Rochester, MI, USA). Fonte: autor.

Foram retirados o fígado, o baço (somente para pesagem,sendo após desprezado) e o estômago, sendo este pesado para ser armazenado: 1º) Um pequeno fragmento do estômago foi retirado e emergido em Bouin por 12 horas e, após, em formol 10%, para posterior análise histológica; 2º) O restante do estômago foi pesado e congelado a –80ºC para as análises de lipoperoxidação, enzimas antioxidantes e avaliação de nitritos e nitratos. O baço foi apenas pesado e, após, desprezado.

Ao

final

do

experimento,

os

animais

sofreram

eutanásia

por

exanguinação sob anestesia profunda, conforme descrito em AVMA Guidelines from Euthanasia [25]. Os corpos dos animais foram acondicionados em embalagens específicas para descarte e mantidos em freezer até sua incineração realizada pelo setor responsável da Unidade de Experimentação Animal do Centro de Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.

3 Materiais e métodos

43

3.3 AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS 3.3.1 Preparação do homogeneizado

Os estômagos foram retirados, pesados e armazenados em freezer 80ºC. Foram, posteriormente, homogeneizados durante 1 minuto em UltraTurrax (IKA-WERK), na presença de cloreto de potássio (KCl) 1,15% (5 mL por g de tecido) e fluoreto de fenil metil sulfonina (PMSF), na concentração de 100 mM em isopropanol (10µL por mL de KCl adicionado). O PMSF é um inibidor de proteases, e foi utilizado para que não houvesse degradação das enzimas, cuja atividade foi medida. Em seguida, os homogeneizados foram

centrifugados por 10 minutos a 3000 rpm (1110 x g) em centrífuga refrigerada (SORVALL RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge), e o sobrenadante retirado e congelado em freezer -80ºC para as dosagens posteriores [60].

3.3.2 Dosagem de proteína

A concentração de proteínas no homogeneizado de estômago foi determinada através do método de Bradford, onde foi utilizada uma albumina bovina (SIGMA) como padrão. As amostras foram mensuradas

espectrofotometricamente 595 nm, e os valores expressos em mg/mL. Esses valores foram utilizados para calcular posteriormente o TBARS e os valores das enzimas antioxidantes [61].

3.4 ANÁLISES DE ESTRESSE OXIDATIVO 3.4.1 Determinação dos níveis de substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico

Com o intuito de avaliar a lipoperoxidação nos grupos presentes neste estudo, utilizamos o método de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

3 Materiais e métodos

44

(TBA-RS). A técnica de TBA-RS consiste no aquecimento do material homogeneizado na presença de ácido tiobarbitúrico e a consequente formação de um produto de coloração rósea, medido em espectrofotômetro a 535nm. O aparecimento de coloração ocorre devido à presença do malondialdeído e outras substâncias provenientes da peroxidação lipídica no material biológico. Foram colocados em tubo de ensaio, nesta ordem de adição, 0,5 mL de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,67%, 0,25mL de água destilada, 0,75mL de ácido tricloroacético (TCA) 10% e 0,25mL do homogeneizado. O TBA reagiu com produtos da lipoperoxidação, formando uma base de Schiff, e o TCA teve função de desnaturar as proteínas presentes, além de acidificar o meio de reação. A seguir, agitou-se cada tubo, que foram aquecidos à temperatura de 100º C durante 15 minutos. Após, os tubos foram resfriados e acrescentou-se 1,5 mL de álcool n-butílico para extrair o pigmento formado. Os tubos foram colocados em agitador (Biomatic) por 45 segundos e centrifugados por 10 minutos a 3000 rpm (1110 x g). Por último, o produto foi retirado e a leitura em espectrofotômetro realizada (CARY 3E – UV – Visible Spectrophotometer Varian) com comprimento de onda de 535nm. A concentração de TBA-RS foi expressa em nmoles/mg de proteína
[62]

.

3.4.2 Atividade da enzima superóxido dismutase

A atividade desta enzima é definida por sua capacidade para inibir um sistema de detecção que reage com o O2-. A reação catalisada é a seguinte:

A técnica de medida da SOD baseou-se na inibição dessa reação. Para tanto, utilizou-se adrenalina que, no meio alcalino, transformou-se em adenocromo, produzindo O2- que é o substrato da enzima. Antes de realizar a determinação com o homogeneizado, fez-se a medida do meio de reação (glicina-NaOH 50 mM, pH 9,6) com 50 L de adrenalina (60 mM, pH 2,0), esta

3 Materiais e métodos

45

correspondendo a 100% da reação. Essa mistura foi agitada e lida a 480 nm. Posteriormente, adicionaram-se diferentes volumes do homogeneizado e mediu-se a inibição da reação. A atividade enzimática foi expressa em unidades SOD/g de tecido (quantidade de SOD que inibe em 50% a velocidade de redução da adrenalina). Para cada amostra medida, repetiram-se os seguintes passos: 1. Colocou-se 950 L de tampão junto com 50 L de amostra e 17 L de adrenalina, após o aparelho ser zerado. 2. Introduziu-se 975 L de tampão junto com 25 L de amostra e 17 L de adrenalina, após o aparelho ser zerado. 3. Acrescentou-se 990 L de tampão junto com 10 L de amostra.

Com os 17 L de adrenalina, procedeu-se da mesma forma que nos itens anteriores. Todas as medidas anteriormente citadas correspondem ao valor de (b). Ao valor de (a) somente corresponde a leitura até ser zerado o aparelho 3.4.3 Atividade da enzima glutationa peroxidase
[63]

.

A enzima catalisa a redução do H2O2, utilizando o GSH como um doador de hidrogênio. A atividade da GPx pode ser estudada, medindo a velocidade de

consumo de NADPH em um sistema que contenha GSH.

3 Materiais e métodos

46

A

técnica

consiste

em

determinar

a

atividade

da

enzima

espectrofotometricamente, medindo-se a velocidade de oxidação de NADPH em uma mistura de reação. Em uma cubeta, foram colocados 500 L de solução reguladora de fosfatos de potássio (100 mM, pH 7,0), 100L de H2O bidestilada, 50 L de Azida Sódica 20mM, com 50 L de glutationa reduzida (GSH) 40mM, 50L de glutationa redutase (GR) e 50 L NADPH. Essa mistura foi encubada durante 3 minutos, e, logo após, foram adicionados 100 L de amostra diluída e 100 L de H2O2. As amostras foram lidas a 340 nm e a atividade foi expressa em nmol/min/mg de proteína
[64]

.

3.5 MEDIDA DE NITRITOS E NITRATOS

Inúmeras células em diferentes tecidos do corpo humano podem produzir óxido nítrico (NO), sendo que, na ausência de estimulação imunológica, a maior parte do NO é produzida pelas células endoteliais e do sistema nervoso central. É uma substância extremamente lábil, com uma meiavida de apenas alguns segundos em sistemas biológicos. Assim sendo, a atividade “in vivo” do NO deve ser monitorizada indiretamente, pois o óxido nítrico rapidamente se oxida em nitritos e predominantemente em nitratos. O NO é uma substância extremamente lábil, com uma meia vida de apenas alguns segundos em sistemas biológicos. Dessa forma, a medida do NO fez-se de forma indireta, através da medida de nitritos e nitratos. Esse método consiste na transformação de nitratos e nitritos, por meio da enzima nitrato redutase. Para isso, utilizou-se, posteriormente, o reativo de Griess. Para realizar a técnica, foram necessários 500 L de amostra, 100 L NADPH (0,2 mM), 70 L Tris Buffer 1M, pH 7,5, 230 L de uma mistura formada por glicose 6-fosfato (50 mM) e glicose 6-fosfato dehidrogenase (100 U/mL), 100 L de nitrato redutase (10/mL), que foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente, foram utilizados 750 L dessa mistura e adicionados 750 L do reativo de Griess, sendo incubada novamente à temperatura

3 Materiais e métodos

47

ambiente, durante 10 minutos. A leitura foi realizada a 550 nm e feita uma curva padrão para a determinação de nitritos e nitratos
[65]

.

3.6 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DOS TECIDOS

O exame histopatológico foi realizado no laboratório de patologia do Centro de Pesquisa Experimental do Hospital de Clínicas de Porto Alegre por um patologista que desconhecia os grupos estabelecidos no delineamento experimental. Para a dissecação anatômica, os estômagos foram colocados em Bouin por 12 horas e, após, em formol 10%. Na etapa seguinte, os blocos de parafina foram fixados ao Micrótomo (Leitz1512), onde se realizaram cortes com 3 micra (3). Na fase de coloração, as lâminas foram mergulhadas nos corantes hematoxilina-eosina durante 5 minutos cada uma e intermediadas por um banho de água corrente. Na fase de desidratação, as estruturas passaram por três recipientes com álcool absoluto e por dois de xilol. Colocou-se a lamínula sobre a lâmina, utilizando-se Bálsamo do Canadá ou Entellan, finalizando, assim, o processo de preparação. As lâminas foram analisadas e fotografadas em microscópio binocular Nikon Labophot nos diferentes aumentos, equipado com câmera digital para captura de imagens por meio do software Image-plus (Media, Cybernetics, Bethesda, USA). O calibre dos vasos foi medido utilizando o mesmo aparelho e software, no qual foram feitas três medidas da luz vascular e, após, calculada uma média para obtenção do calibre de cada vaso analisado, obtendo o valor em pixels.

3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A partir dos dados coletados, as médias e os erros padrões das médias de cada grupo foram calculados, utilizando para análise estatística o software Graphpad Instat, versão 3.0 para Windows XP2000. Foi realizada análise de variância (ANOVA) de duas vias, seguida de teste Student-Newman-Keuls para múltiplas comparações, sendo o nível de significância adotado de 5% (P<0,05).

4 RESULTADOS

A apresentação dos resultados segue a seguinte ordem no modelo experimental utilizado nesta pesquisa: 1. Avaliar a alteração da pressão portal nos grupos experimentais; 2. Avaliar a integridade hepática neste modelo experimental através dos níveis séricos das aminotransferases aspartato (AST) e alanina (ALT), e da fosfatase alcalina (FA) nos grupos experimentais; 3. Avaliar os níveis de substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) nos estômagos dos animais dos diferentes grupos experimentais; 4. Avaliar a atividade enzimática antioxidante através da medida das concentrações da enzima Superóxido Dismutase (SOD) nos estômagos dos animais dos diferentes grupos experimentais; 5. Avaliar a atividade enzimática antioxidante através da medida das concentrações da enzima Glutationa Peroxidase (GPx) nos estômagos dos animais dos diferentes grupos experimentais; 6. Avaliar os metabólitos do NO (Nitritos e Nitratos) nos estômagos dos animais dos diferentes grupos experimentais; 7. Determinar os aspectos histológicos pela técnica de hematoxilina e eosina nos estômagos dos animais dos diferentes grupos experimentais, bem como o calibre dos vasos.

4.1 VERIFICAÇÃO DA ALTERAÇÃO DA PRESSÃO PORTAL

Houve aumento estatisticamente significativo na pressão portal dos grupos LPVP em relação aos demais grupos experimentais. Observa-se diminuição significativa nos valores de pressão portal nos animais do grupo LPVP + NAC.

4 Resultados

49

Pressão Portal (mmHg)

35 30 25 20 15 10 5 0 SO SO+NAC

* * ** *

*

LPVP

LPVP+NAC

Figura 16: Efeito da administração da N-acetilcisteína (NAC) sobre os níveis de pressão portal nos grupos SO: Sham-operated, SO +NAC, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC. Dados expressos como a média ± erro padrão, n= 6 animais cada grupo. As notações sobrescritas têm a seguinte significância: *: diferença significativa do grupo LPVP em relação aos demais grupos (P<0,001); **: diferença significativa do grupo LPVP+NAC em relação ao grupo LPVP (P<0,001). 4.2 PROVAS DE INTEGRIDADE HEPÁTICA

Nas provas de integridade hepática (PIH), foram avaliadas as transaminases (AST e ALT) e a fosfatase alcalina (FA), todas expressas em U/L. Os valores encontrados para as TIH não foram estatisticamente significativos entre os quatro grupos.

Figura 17: Efeito da administração da N-acetilcisteína (NAC) sobre os níveis das enzimas hepáticas AST, ALT e FA nos grupos SO: Sham-operated, SO +NAC, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC. Dados expressos como a média ± erro padrão, n= 6 animais cada grupo. Não houve diferença estatística.

4 Resultados

50

4.3 AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE SUBSTÂNCIAS QUE REAGEM AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO

Os valores de lipoperoxidação no estômago demonstraram aumento significativo no grupo LPVP, sendo P<0,001 em relação a todos os demais grupos (SO, SO + NAC e LPVP+NAC). Os animais tratados com Nacetilcisteína demonstraram uma diminuição significativa (P<0,001) quando comparados ao grupo LPVP.
TBARS (nmol/msgprot)
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 SO SO+NAC LPVP LPVP+NAC

*

**

Figura 18: Efeito da administração da N-acetilcisteína (NAC) sobre os níveis de TBARS nos grupos SO: Sham-operated, SO +NAC, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC. Dados expressos como a média ± erro padrão, n= 6 animais cada grupo. As notações sobrescritas têm a seguinte significância: *: diferença significativa do grupo LPVP em relação aos demais grupos (P<0,001); **: diferença significativa do grupo LPVP+NAC em relação ao grupo LPVP (P<0,001).

4.4

AVALIAÇÃO

DA

ATIVIDADE

ENZIMÁTICA

ANTIOXIDANTE

SUPERÓXIDO DISMUTASE

Na Figura 19, são apresentados os resultados da atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) no homogeneizado de estômago dos animais dos diferentes grupos, mostrando uma diminuição significativa no grupo LPVP em relação aos demais (P<0,05) e um aumento significativo da atividade dessa enzima no grupo LPVP +NAC (P<0,05).

4 Resultados

51

30

SOD (U/mgprot)

25 20 15 10 5 0 SO SO+NAC

*

**

*

LPVP

LPVP+NAC

Figura 19: Efeito da administração da N-acetilcisteína (NAC) sobre os níveis de SOD nos grupos SO: Sham-operated, SO +NAC, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC. Dados expressos como a média ± erro padrão, n= 6 animais cada grupo. As notações sobrescritas têm a seguinte significância: *: diferença significativa do grupo LPVP em relação aos demais grupos (P<0,05); **: diferença significativa do grupo LPVP+NAC em relação ao grupo LPVP (P<0,05).

4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA ANTIOXIDANTE GLUTATIONA * PEROXIDASE * Na atividade da GPx, foi observado um comportamento similar à enzima SOD, em que observamos uma diminuição significativa da atividade dessa enzima nos animais do grupo LPVP em relação aos demais (P<0,05) e um * aumento significativo desses valores no grupo LPVP+NAC quando comparado ao grupo LPVP (P<0,05).
1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 SO SO+NAC

GPx (nmol/mgprot)

** *

LPVP

LPVP+NAC

4 Resultados

52

Figura 20: Efeito da administração da N-acetilcisteína (NAC) sobre os níveis de GPx nos grupos SO: Sham-operated, SO +NAC, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC. Dados expressos como a média ± erro padrão, n= 6 animais cada grupo. As notações sobrescritas têm a seguinte significância: *: diferença significativa do grupo LPVP em relação aos demais grupos (P<0,05); **: diferença significativa do grupo LPVP+NAC em relação ao grupo LPVP (P<0,05). 4.6 AVALIAÇÃO DOS METABÓLITOS DO NO

Na Figura 21, observamos os valores referentes aos nitritos e nitratos no homogeneizado de estômago de ratos dos nossos grupos experimentais. Observa-se aumento significativo dos nitratos totais nos grupos LPVP em relação aos grupos SO, SO+NAC e LPVP+NAC, sendo P <0,01. Os animais do grupo LPVP +NAC apresentaram uma redução significativa desses valores (P<0,05).

1,2

*
Nitritos e nitratos ( umol/L)
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 SO SO+NAC LPVP LPVP+NAC

**

Figura 21: Efeito da administração da N-acetilcisteína (NAC) sobre os níveis * de NO nos grupos SO: Sham-operated, SO +NAC, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC. Dados expressos como a média ± erro padrão, n= 6 animais cada grupo. As notações sobrescritas têm a seguinte significância: *: diferença significativa do grupo LPVP em relação aos demais grupos (P<0,01); **: diferença significativa do grupo LPVP+NAC em relação ao grupo LPVP (P<0,05).

4 Resultados

53

4.7 DETERMINAÇÃO DOS ASPECTOS HISTOLÓGICOS PELA COLORAÇÃO DE HEMATOXILINA E EOSINA

A histopatologia foi realizada por meio de coloração de hematoxilinaeosina dos animais dos grupos controle (SO), com ligadura parcial de veia porta (LPVP), e os animais com ligadura parcial de veia porta foram tratados com N-acetilcisteína (LPVP+G). Na Figura 22A, a fotomicrografia do estômago do grupo controle (SO) mostra a mucosa gástrica no padrão normal. Já na Figura 22B, observa-se a fotomicrografia do estômago do grupo com ligadura parcial de veia porta (LPVP), mostrando alterações na mucosa gástrica, como a presença de edema e vasodilatação na submocosa dos animais desse grupo. Na Figura 22C, apresenta-se a fotomicrografia do estômago do grupo LPVP tratado com Nacetilcisteína (LPVP+NAC), na qual se observa a redução do calibre dos vasos na mucosa gástrica desses animais. Devido á semelhança da histologia entre os grupos SO e SO +NAC, optamos por não incluir a fotografia do grupo SO + NAC neste presente trabalho.

G

Figura 22: Fotomicrografia de estômago de animais dos grupos. A: controle (SO), B: LPVP e C: LPVP + NAC, com coloração de hematoxilinaeosina em aumento (100x). Observa-se área glandular (G), muscular da mucosa (MM) e submucosa (SM).

Na Figura 23, apresenta-se o gráfico dos valores do calibre dos vasos A sanguíneos presentes na mucosa gástrica dos animais do grupo LPVP, onde se observa um aumento significativo do calibre dos vasos (P<0,001) e os

4 Resultados

54

animais do grupo LPVP +NAC apresentam uma redução do calibre dos vasos da mucosa gástrica (P<0,001). Não mensuramos o calibre dos vasos dos animais do grupo SO + NAC, devido á semelhança da histologia entre este grupo e o grupo SO.

160

Calibre dos vasos (pixels)

140 120 100 80 60 40 20 0 SO

*

LPVP

LPVP+NAC

Figura 23: Valores médios obtidos na mensuração do calibre dos vasos nos grupos SO: Sham-operated, LPVP: Ligadura parcial da veia porta e LPVP + NAC. Resultados expressos como a média ± erro padrão, n= 6 animais cada grupo. As notações sobrescritas têm a seguinte significância: *: diferença significativa do grupo LPVP em relação aos demais grupos (P<0,001).

5 DISCUSSÃO

A hipertensão portal é uma síndrome associada ao desenvolvimento da circulação hiperdinâmica, que se caracteriza por vasodilatação e aumento do débito cárdiaco e/ou fluxo sanguíneo. Essa síndrome é a principal causa de mortalidade entre os pacientes cirróticos, embora nem sempre a hipertensão portal seja associada à cirrose hepática, podendo ser consequência de outras etiologias [67]. O desenvolvimento dos colaterais portossistêmicos é uma resposta vascular ao aumento da pressão no sistema portal, característico da HP. Dentre esses, as varizes gastro-esofágicas são as mais proeminentes, sendo essa uma tentativa de desviar o sangue represado no sistema porta para a circulação sistêmica, descomprimindo o território esplâncnico
[68]

.

A

vasodilatação que ocorre no estômago desencadeia o quadro de gastropatia da hipertensão portal. A progressiva dilatação vascular no estômago de pacientes acometidos pela GHP leva a sangramento
[16]

e

consequentemente

hemorragia

gastrointestinal, acompanhados por outras manifestações clínicas como a anemia ferropenica crônica . A taxa de mortalidade de 30% associada a

cada episódio hemorrágico é preocupante, e dessa forma a busca por um tratamento eficaz se faz necessária, na tentativa de diminuir essa alarmante porcentagem. Nas últimas décadas, avanços significantes em opções de tratamento para o desenvolvimento de varizes gastroesofágicas e hemorragia

gastrintestinal foram feitos. No entanto, nenhum tratamento específico demonstrou eficácia na prevenção do sangramento dessas varizes. A prevenção do primeiro sangramento depende do tamanho e características das varizes. As recomendações clínicas para pacientes com varizes pequenas e com alto risco de hemorragia é o uso de betabloqueadores. Em caso de varizes médias/grandes, o tratamento é feito

também com beta-bloqueadores ou é realizada ligadura esofágica. Ainda,

5 Discussão

56

tratamentos padrões para pacientes com varizes consistem em drogas vasoativas e profilaxia com antibióticos. A anastomose portossistêmica intrahepática transjugular (TIPS) é reservada para aqueles que não responderam a esses tratamentos ou para pacientes que estão propensos a sangrar ("TIPS prematuros") [69]. Nesse contexto, a utilização de outras substâncias químicas capazes de impedir o desenvolvimento de tais complicações poderia ser uma alternativa vantajosa e um possível caminho para a diminuição dessa alta taxa de mortalidade. Para isso, é necessário o uso de modelos experimentais em que figurem as alterações decorrentes na hipertensão portal em humanos para que possamos estudar e entender o mecanismo fisiopatológico dessa doença e buscar, assim, uma terapia alternativa para a minimização desses danos. No caso da HP, o uso de modelos animais vem contribuindo para o melhor entendimento dessa doença, bem como a busca por esses tratamentos alternativos. Muitos são os modelos experimentais utilizados para estudar as complicações da hipertensão portal intra, pré e pós-hepática ligadura parcial da veia porta (LPVP) um modelo pré-hepático. Em um modelo pré-hepático, como o utilizado neste trabalho, observamos dilatação dos vasos esplâncnicos e desenvolvimento de expressiva circulação colateral, que determina o surgimento de varizes gastroesofágicas, caracterizando a síndrome portal hipertensiva [67]. A ligadura parcial da veia porta é um modelo experimental clássico e muito utilizado, já que foi bem estabelecido em 1985 por Sikuler [3], e simula a hipertensão portal pré-hepática e suas consequências de forma eficaz. Em 7 dias, a HP encontra-se totalmente estabelecida, apresentando as alterações vasculares porém sem dano hepatocelular [4]. No presente trabalho, utilizamos este modelo experimental, e avaliamos a pressão portal, a integridade hepática, o estresse oxidativo, metabólitos do óxido nítrico e alterações histológicas em ratos tratados com o antioxidante Nacetilcisteína.
[4]

, sendo a

5 Discussão

57

No oitavo dia após a cirurgia LPVP, uma vez que o quadro da circulação hiperdinâmica já estava estabelecido
[1,10]

, iniciamos o tratamento com a NAC,

para observarmos se este antioxidante seria capaz de minimizar os danos gástricos infligidos pelo surgimento da circulação colateral no estômago. Aferimos os valores de pressão portal (PP) (Figura 17) no 15º dia após a cirurgia, e observamos que houve um aumento em animais do grupo LPVP quando comparado aos demais. Esse resultado já era esperado, uma vez que o modelo experimental utilizado neste trabalho é caracterizado pelo aumento da pressão no sistema porta. Esse dado demonstrou a eficiência do modelo, bem como a eficácia da N-acetilcisteína em reduzir os valores de PP nos animais que foram tratados com esse antioxidante, sendo esse valor significativo em relação aos animais porta-hipertensos. Esses resultados foram semelhantes em trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa, que utilizaram os antioxidantes quercetina e glutamina
68] [43,

. A NAC foi utilizada como tratamento em modelo de hipertensão portal
[17]

em estudo anterior de Fernando et al. ,1998

, no qual foi demonstrado que a

administração de N-acetilcisteína reduziu a circulação hiperdinâmica nos animais que sofreram a ligadura parcial da veia porta. Esse resultado é decorrente do efeito da NAC, principalmente, sobre a pressão portal, pressão arterial média e débito cardíaco. Como resultados das análises das aminotransferases aspartato (AST) e alanina (ALT) e da fosfatase alcalina (FA), não observamos diferença estatística entre os grupos amostrados (Figura 18). Quando ocorre um dano hepático, as enzimas podem extravasar para o plasma, tornando-se um excelente marcador de lesão no fígado
[70]

. As aminotransferases (AST e ALT),

quando alteradas, apontam hepatite aguda (viral ou tóxica), crônica, doenças obstrutivas de via biliar, entre outras. Alterações de valores da enzima FA frequentemente indicam, doença hepatobiliar
[12]

. Os dados encontrados no

nosso estudo refletem o fato de que neste modelo experimental não há alteração da integridade hepática, em virtude de se tratar de um modelo préhepático [54], no qual o dano hepatocelular é inexistente.

5 Discussão

58

Com o intuito de avaliar a lipoperoxidação neste modelo experimental bem como o efeito da N-acetilcisteína sobre esse parâmetro, utilizamos a técnica de mensuração dos níveis de substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). O estresse oxidativo está associado à hipertensão portal
[72] [43,71]

e o

quadro de gastropatia diretamente relacionado à superprodução de EROS e altos níveis de lipoperoxidação . Observamos, neste trabalho, um aumento

significativo dos níveis de substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) nos animais do grupo LPVP, comparados aos demais. Quando a Nacetilcisteína foi administrada no grupo doente, observamos que os valores se mostraram mais baixos, apontando uma redução da lipoperoxidação nos animais que receberam a NAC (Figura 19). O fato de que a ligadura parcial da veia porta leva a dano oxidativo foi inicialmente proposto por Fernando et al., 1998, afirmando que a geração de espécies reativas de oxigênio pode estar intimamente relacionada com as alterações hemodinâmicas observadas na hipertensão portal
[72] [17]

. Kinjo et al.,

2008 também observaram altos níveis de lipoperoxidação e nitrotirosina neste modelo experimental .

A peroxidação lipídica é definida como a deterioração oxidativa de lipídios poliinsaturados
[22]

. Isso ocorre através de um processo de reações em

cadeia na membrana plasmática celular podendo levar à inativação de proteínas de transporte ou enzimas de membrana, comprometendo, dessa forma, a homeostase da célula [21]. Ainda, em doenças hepáticas como a hepatite, cirrose e

hepatocarcinoma, observaram-se níveis elevados de LPO no estômago, sugerindo o envolvimento do estresse oxidativo nas lesões da mucosa gástrica nessas hepatopatias
[79]

. Resultados similares foram encontrados em nosso

trabalho ao avaliarmos o nível de lipoperoxidação no estômago de animais submetidos ao modelo de LPVP.

5 Discussão

59

A N-acetilcisteína possui a habilidade de interagir com os agentes oxidantes, agindo como scavenger de radicais livres. Ainda, a NAC contribui para a restauração da glutationa, importante antioxidante não-enzimático [74]. Assim, a redução da lipoperoxidação neste trabalho, através do uso da NAC, é justificada pelas suas propriedades antioxidantes. Resultados similares foram encontrados em 1998, quando a lipoperoxidação foi avaliada com a mensuração de F2-Isoprostanos
[17]

. No entanto, os mecanismos através dos

quais a NAC reduziu o estresse oxidativo não foram elucidados. Quando se avaliou as atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e glutationa peroxidase, observamos uma redução significativa em ambas nos animais do grupo LPVP quando comparadas aos demais. A NAC foi capaz de restaurar a atividade dessas enzimas, estando os valores do grupo LPVP + NAC significativamente aumentados em relação ao grupo LPVP. O sistema de defesa antioxidante, tanto enzimático como não-enzimático, é encarregado de manter baixas as concentrações de EROS. Para tanto, esse sistema age prevenindo a formação dessas espécies, promovendo a sua captura, ou reparando o dano causado por tais moléculas. Em mamíferos, as enzimas SOD são descritas como três isoformas: a citosólica, a mitocondrial e a extracelular, que são metaloenzimas abundantes em células aeróbias e enzimas antioxidantes extremamente importantes na manutenção do equilíbrio oxidativo. Cabe a essas enzimas a dismutação do radical superóxido a peróxido de hidrogênio, que é menos reativo e pode ser degradado por outras enzimas, como a catalase e a glutationa peroxidase. Podemos dizer que esse sistema compreende a primeira linha de defesa antioxidante do nosso organismo no combate às espécies reativas de oxigênio
[63]

. A GPx é uma peroxidase específica que faz parte de um grupo de

enzimas que utilizam uma variedade de redutores celulares para inativar peróxidos. Além de agirem sob o peróxido de hidrogênio, neutralizam também peróxidos orgânicos como os alquil-hidro-peróxidos [64]. Essas enzimas também são de significante importância, pois a GPx, em associação com outras

5 Discussão

60

enzimas, pode prevenir a interação do O 2°-, H2O2 e íons metálicos que levariam à formação do radical OH° [75]. SOD e GPx, ambas, demonstraram uma diminuição significativa no grupo LPVP em relação aos demais. Quando os animais foram tratados com NAC, observamos uma restauração dos níveis de atividade dessas enzimas (Figuras 20 e 21). A redução dos valores das enzimas SOD e GPx, bem como o aumento da lipoperoxidação, corrobora com estudo anterior que avaliou o dano oxidativo causado por lesões na mucosa gástrica
[6]

. Em nosso grupo, em outros

modelos experimentais associados ao estresse oxidativo, observamos o mesmo comportamento dessas enzimas, que se mostraram diminuídas nos grupos dos animais doentes [82,83]. O decréscimo da SOD está em conformidade com pesquisas anteriores
[68,43,71]

, sendo que a diminuição da atividade dessa enzima pode levar a um

aumento da lipoperoxidação. A redução dos valores dessa enzima parece estar relacionada à sua ação sobre os ânions superóxido, aumentados na hipertensão portal. A SOD estaria sendo utilizada na dismutação das EROS para posterior formação de H2O2. Ainda, a combinação do O2°- com o NO também pode levar a um dano oxidativo bastante elevado em virtude da consequente produção de ONOO- [76]. A NAC mostrou-se eficaz em restaurar os níveis de atividade dessa enzima (Figura 20). Estudos anteriores demonstraram que o tratamento

antioxidante foi capaz de minimizar o decréscimo na atividade da SOD, através do uso de quercetina e glutamina neste mesmo modelo experimental. Isso demonstra, consequentemente, uma redução do estresse oxidativo e uma melhora no dano gástrico infligido pela ligadura parcial da veia porta
[43,68]

.

A atividade da GPx avaliada no grupo LPVP também se mostrou diminuída, sendo o tratamento com a NAC eficaz em aumentar esses níveis nos animais do grupo LPVP + NAC (Figura 21). Essa enzima já foi previamente implicada como um possível mediador de redução de dano na mucosa gástrica em virtude do aumento dos níveis de cisteína
[74]

. A N-acetilcisteína age como uma precursora da GSH, facilitando a

5 Discussão
[77]

61

sua biossíntese

, o que explica o aumento dos valores da GPx nos animais

que receberam a NAC. A atividade antioxidante da N-acetilcisteína também já foi demonstrada , em trabalho anterior do nosso grupo de pesquisa, que utilizou modelo experimental de cirrose biliar secundária
[78]

. Em tal trabalho, a NAC foi capaz

de reduzir a lipoperoxidação e aumentar a atividade da enzima SOD no pulmão de ratos submetidos à ligadura de ducto biliar comum. Avaliamos também nesse presente trabalho os níveis de metabólitos do óxido nítrico, nitritos e nitratos. Nossos resultados demonstraram um aumento significativo de NO nos animais do grupo LPVP em relação aos demais e uma redução significativa desses valores nos animais do grupo LPVP +NAC (Figura 22). O óxido nítrico parece estar intimamente relacionado com o

desenvolvimento da circulação hiperdinâmica na hipertensão portal. A obstrução ao fluxo sanguíneo, tanto pré, intra ou pós-hepática, leva ao represamento do sangue no sistema portal, ocasionando o aumento de pressão no território esplâncnico. Nessa região, ocorre estresse de

cisalhamento e consequente liberação de agentes vasodilatadores, dentre eles o NO. Uma expressão e atividade aumentada da eNOS, fatores circulantes vasoativos (endotelina, angiotensina II, vasopressina, norepinefrina) e do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) também contribuem para o desenvolvimento da circulação colateral nesta doença [3]. Sendo assim, ao avaliarmos os metabólitos do NO em homogeneizado de estômago, observamos valores significativamente aumentados no grupo LPVP em relação aos demais. Esse aumento pode ser explicado pela progressiva dilatação dos vasos devido ao aumento da pressão portal, que tem o objetivo de desviar o sangue da área obstruída para a circulação sistêmica. Esse fenômeno contribui para o aumento de estresse oxidativo, uma vez que o NO pode reagir com o ânion superóxido e formar o radical peroxinitrito, espécie reativa extremamente danosa ao nosso organismo contribuindo, assim, para o estresse[76].
[81]

. Ainda, pode reagir com

nitrosotióis, dióxido de nitrogênio (NO2) e outras espécies nitrosativas,

5 Discussão

62

Nossos resultados demonstraram uma redução do NO nos animais tratados com a N-acetilcisteína, colaborando para o decréscimo da circulação hiperdinâmica, bem como redução do estresse oxidativo nesse modelo experimental. Moreira et al., 2004 e Marques et al., 2011 apontaram que o tratamento antioxidante com a quercetina e a glutamina foi capaz de reduzir o NO,
[68,43]

contribuindo para a manutenção da integridade da mucosa gástrica
[78]

.

A NAC, por sua vez, reduziu a superprodução de óxido nítrico em modelo experimental de cirrose . Em nosso estudo, observamos o mesmo

comportamento dessa droga em modelo experimental de hipertensão portal. A hipótese para a redução da biodisponibilidade do óxido nítrico com o uso da N-acetilcisteína se baseia em sua ação inibitória sob a produção de NO
[78]

. A combinação do componente tiol da NAC com o NO produz um composto

chamado nitritiol, que pode preservar e acumular óxido nítrico na sua forma biologicamente ativa. Quando isso ocorre, sugere-se que esta molécula está agindo como um antioxidante, uma vez que reduz a formação de peroxinitrito através da inibição da produção de NO
[9]

.

Com o intuito de elucidarmos os efeitos da N-acetilcisteína na mucosa gástrica de ratos submetidos ao modelo experimental de LPVP, promovemos a avaliação histológica do estômago dos grupos amostrados nesse trabalho através de lâminas coradas com HE. Observamos que os animais com hipertensão portal apresentaram presença de edema e vasodilatação na submucosa (Figura 24). Esses resultados foram opostos aos animais do grupo controle, nos quais observamos uma preservação da integridade gástrica (Figura 23). Quando os animais do grupo LPVP foram tratados com a NAC, observamos uma atenuação desse quadro, com significativa redução da vasodilatação (Figura 25). Estudos anteriores também demonstraram uma atenuação do quadro de circulação hiperdinâmica nesse modelo experimental, bem como a diminuição do dano à mucosa gástrica, ambos os parâmetros avaliados através da histologia. Esse resultado foi obtido através do uso da terapia antioxidante
68] [43,

.

5 Discussão

63

Por último, avaliamos o calibre dos vasos presentes na submucosa gástrica dos animais do nosso experimento. Constatamos, com esses resultados, que os animais do grupo tratado com a NAC apresentaram uma redução significativa do calibre vascular, quando comparados aos animais do grupo LPVP, os quais demonstraram um aumento significativo desses valores (Figura 26). Observando o quadro geral, constatamos que a minimização dos danos na mucosa gástrica, avaliados na histologia, veio acompanhada de uma melhora nos parâmetros de estresse oxidativo (avaliados através das enzimas antioxidantes SOD e GPX e lipoperoxidação por TBARS), e de uma redução dos metabólitos do óxido nítrico. Dessa forma, diante dos resultados do presente trabalho, sugerimos que a N-acetilcisteína foi eficaz em reduzir dos danos decorrentes na mucosa gástrica de ratos pela LPVP. Assim, essa droga pode ser sugerida como uma alternativa terapêutica na atenuação dessa doença.

6 CONCLUSÕES

1) Através dos resultados obtidos nos valores da pressão portal, concluimos que o grupo LPVP demonstrou um aumento significativo da pressão no sistema portal, sendo a N-acetilcisteína capaz de reduzir os valores nesse modelo experimental. 2) Na avaliação dos testes de integridade hepática, através de medidas de concentração sérica de aminotransaminases (AST e ALT) e fosfatase alcalina (FA), não observamos nenhuma diferença estatística entre os grupos. Concluímos, dessa forma, que nem o modelo LPVP nem a NAC infligiram dano no fígado dos animais utilizados para este trabalho. 3) Ao avaliarmos a lipoperoxidação nos grupos pertencentes a este estudo, através da técnica de TBARS, observamos que houve um aumento no grupo LPVP em relação aos demais, sendo a NAC eficaz na redução desse dano na mucosa gástrica. Este dado foi obtido na análise do nível de lipoperoxidação no grupo LPVP + NAC, que se mostrou reduzido em relação ao grupo LPVP. 4) A enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD) apresentou uma diminuição significativa nos animais do grupo LPVP em relação aos demais. O grupo LPVP+NAC mostrou atividade restaurada dessa enzima antioxidante. 5) A enzima antioxidante glutationa peroxidase (GPx) mostrou uma redução nos animais do grupo LPVP e após tratamento com a NAC, esses valores mostraram-se significativamente aumentados. 6) Ao avaliarmos os metabólitos do NO, nitritos e nitratos, observamos um aumento significativo desses valores nos animais LPVP. O tratamento com a NAC foi capaz de reduzir a biodisponibilidade do NO, contribuindo, provavelmente, para a redução da gastropatia da hipertensão portal.

6 Conclusões

65

7) Na avaliação histopatológica do estômago de ratos com LPVP, observou-se o desenvolvimento de edema e vasodilatação no grupo LPVP. Ainda, os animais pertencentes a esse grupo demonstraram um aumento do calibre dos vasos na submucosa, confirmando a dilatação exacerbada dos vasos nesse modelo experimental. O tratamento com a NAC contribui para a redução da vasodilatação observada pelo calibre dos vasos no grupo LPVP +NAC. A partir desses achados, podemos concluir que a N-acetilcisteína protege a mucosa gástrica dos ratos com gastropatia da hipertensão portal provocada pela LPVP, possivelmente devido às suas propriedades antioxidantes.

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ANEXOS

Anexos

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ANEXO A - Artigo redigido com os resultados da presente dissertação

Antioxidant effect of N-acetylcysteine on prehepatic portal hypertensive gastropathy

Authors Francielli Licks Federal University of Rio Grande do Sul Paulo Gama, 110 90040-060 Brazil – Porto Alegre/RS francielli.licks@gmail.com – Corresponding author Camila Marques Federal University of Rio Grande do Sul Paulo Gama, 110 90040-060 Brazil – Porto Alegre/RS camilam14@gmail.com Cláudio Zettler Lutheran University of Brazil Farroupilha, 8001 92425-900 Brazil – Canoas/RS zetler@terra.com.br

Anexos

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Cláudio Augusto Marroni Federal University of Health Sciences of Porto Alegre Sarmento Leite, 245 90050-170 Brazil – Porto Alegre/RS proreitorias@ufcspa.edu.br Maria Isabel Morgan Martins Lutheran University of Brazil Farroupilha, 8001 92425-900 Brazil – Canoas/RS morganmartins@terra.com.br Norma Possa Marroni Clinical Hospital of Porto Alegre Ramiro Barcelos, 2.350 90035-903 Brazil – Porto Alegre/RS nmarroni@terra.com.br ABSTRACT BACKGROUND: Portal Hypertension (PH) is a clinical syndrome associated with the development of a hyperdynamic circulation and gastroesophageal varices. The aim of this study was to evaluate the antioxidant effect of N-Acetylcysteine on portal hypertensive rats. METHODS: PH was induced by partial portal vein ligation (PPVL). The oxidative damage in the stomach was measured by lipoperoxidation trough thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and antioxidant enzyme activity; we also evaluated nitrates

Anexos

78

and nitrites level and histology stained by hematoxylin-eosin. We performed evaluation of portal pressure and measurement of vessels diameter. Liver damage was evaluated by measuring hepatic enzymes. The animals were divided in four experimental groups (n=6): Sham-operated (SO), SO + NAC, Partial portal vein ligation (PPVL) and PPVL + NAC. N-acetylcysteine (10 mg/kg ip) was administered daily for 7 days and started 8 days after surgery. RESULTS: All data are presented as means ± standard error. There was no difference between the values of hepatic enzymes. The portal hypertensive group showed an increase in portal pressure, vessels diameter, levels of TBARS and nitrates and nitrites when compared to SO group. These values were accompanied by a decrease in superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx) antioxidant enzyme activity. Histology showed dilated vessels in the gastric mucosa in the PPVL group. Treatment with NAC was able to decrease portal pressure values, vessels diameter, TBARS and also nitrates and nitrites levels when compared to PPVL group. Furthermore, PPVL+NAC group presented an increase in SOD and GPx activity. In histological evaluation, N-acetylcysteine attenuated damage in gastric mucosa. CONCLUSIONS: The data allow us to conclude that oxidative stress is associated with portal hypertension and that antioxidant NAC is able to minimize damages of PPVL in rats. Key gastropathy BACKGROUND Portal hypertension (PH) is a clinical syndrome which is Words: Antioxidant, N-Acetylcysteine, Portal hypertensive

hemodynamically defined as a pathological increase in portal pressure, with consequent formation of porto-systemic collaterals that deviate blood flow from the portal system directly to systemic circulation [1].

Anexos

79

In clinical PH, the emergence of this collateral circulation leads to dilatation of vessels especially in the stomach and esophagus, leading to portal hypertensive gastropathy (PHG), which is characterized by vasodilation in the gastric submucosa. These hemodynamic disturbances lead to bleeding in 8090% of cases [2] due to the progressive dilatation of vessels that break and lead to hemorrhage [1]. Partial Portal Vein Ligation (PPVL) is the most used experimental model to study the pathophysiology of prehepatic portal-hypertension gastropathy. It has been developed by Sikuller
[8]

and several experimental studies

demonstrated that PPVL manifests gastric abnormalities equivalent to PHG in humans
[7].

One week after PPVL the operated animals already develop PHG

and approximately 100% of these animals present portosystemic shunting and hyperdynamic circulation, in other words, collateral vessels [7]. Oxidative stress has been appointed as trigger factor to the progression of several diseases. In PH, it is related to the development of the hyperdinamic circulation
[47]

and to the overproduction of nitric oxide (NO). Recently,

increased NO serum levels were found in patients with portal hypertensive gastropathy, being implicated in the pathogenesis of this disease
[48].

The

enhanced synthesis of NO induces peroxynitrite formation by reaction to other reactive species of oxygen, therefore increasing oxidative damage to the gastric mucosa [39]. The use of antioxidant therapy may minimize the effects of oxidative stress in portal hypertension
[3].

N-Acetylcysteine (NAC) is a reliable,

inexpensive and well-tolerated antioxidant, with a well-known mechanism. Treatment with NAC was found to improve the levels of glutathione, the major endogen antioxidant of humans. NAC can also decrease the bioavailability of nitric oxide by binding its thiol component with it and forming nitrotiol [46]. The primary aim of this study was to evaluate the antioxidant action of NAC by assessing liver integrity, stomach lipoperoxidation through

thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), the activity of antioxidant

Anexos

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enzymes superoxide dismutase and glutathione peroxidase, as well as perform the measurement of nitrites and nitrates and histological analysis in stomach of rats submitted to the experimental model of PPVL. METHODS Ethics The experimental procedures complied with the rules established by the Research Ethics Committee of the Lutheran University of Brazil, Canoas, RS, Brazil. Animals Twenty-four male Wistar rats weighing 250g were used. They were obtained from State Foundation of Production and Research in Health (FEPPS), Porto Alegre, RS. They were kept at the vivarium of the Lutheran University of Brazil in plastic boxes measuring 47x34x18cm lined with wood chips, under a 12-hours dark/light cycle (light from 7 a.m. to 7 p.m.) at a temperature of 22 ±± 4°C. The rats were fed 16 g per animal/day on rat chow (Purina-Nutripal, Porto Alegre, RS, Brazil) and had water ad libitum. Groups and Treatment Protocols The animals were divided in four experimental groups (n=6): Shamoperated (SO), SO + NAC, Partial portal vein ligation (PPVL), and PPVL + NAC. N-Acetylcysteine (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA; CAS registry number 616-91-1) was dissolved in 0.6 ml of 0.9% NaCl and injected in a dose of 10 mg/kg intraperitonially of animal weight
[41].

The animals of the PPVL and

SO groups received the same volume of vehicle, without NAC, for the same period as the ones in PPVL+NAC and SO+NAC groups. It was administered daily starting on day 8 after surgery and extended for 7 days.

Anexos Portal Hypertension Induction

81

The animals were anesthetized with ketamine hydrochloride (100mg/kg ip) and xylazine hydrochloride (50 mg/kg ip). After a medium incision in the abdomen, bowels were gently withdrawn on a humidified gauze with saline and the portal vein was isolated. A 20g needle was placed on the portal vein and both were tied up using a 3.0 silk yarn, the needle being gently withdrawn after ligation. Afterwards, we tested for the absence of portal vein thrombosis by manipulating the spot. [8]. The sham-operated group was submitted to the same procedure, although their portal veins did not undergo partial portal vein ligation. Euthanasia On day 15 after the surgery the animals were anaesthetized with ketamine hydrochloride (100 mg/kg) and xylazine hydrochloride (50 mg/kg ip). Through a heparinized capillary, a blood sample was taken from the retroorbital plexus in order to assess liver integrity by aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotranferase (ALT), and alkaline phosphatase (FA)
[9].

The

abdomen was shaved, followed by laparotomy, and the stomach was removed for histological analysis to evaluate the tested segment; the rest was frozen – 80°C for later biochemical analysis. The animals were killed by exsanguination under deep anaesthesia [10,11]. Measurement of Portal Pressure Portal pressure was measured in mmHg on a Poligraph 2006 (Lettica Scientific Instruments, Barcelona, Spain) by cannulation of the mesenteric vein with a catheter. Stomach Homogenates The stomachs were cut with scissors and weighed. Five millilitres of phosphate buffer (140 mM KCL, 20 mM phosphate, pH 7.4) per tissue gram was

Anexos

82

added, and the tissue was homogenized in an Ultra Turrax (IKA-WERK) for 40 seconds at 4°C. Next, it was centrifuged for 10 minutes at 4.000 rpm (2150.4 x g) (SORVALL RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge). The supernatant was pipetted into Eppendorf flasks, and the precipitate was discarded. The samples were stored again at –80°C for posterior analyses. Protein We used the Bradford method to quantify protein, with bovine albumin as the standard (SIGMA®). The samples were measured spectrophotometrically at 595 nm, and values expressed in mg/mL were used to calculate values of TBARS (thiobarbituric acid–reactive substances) and antioxidant enzymes [12]. Stomach Liperoxidation The amount of aldehydes generated by lipid peroxidation is measured by the TBARS method, which measures the amount of substances reacting with thiobarbituric acid. The samples were incubated at 100°C for 30 minutes after addition of 500 μL of 0.37% thiobarbituric acid in 15% trichloroacetic acid and centrifuged at 3000 rpm (1612.8 x g) for 10 minutes at 4°C. Absorbance was determined spectrophotometrically at 535 nm and values were expressed in nmol/mgprot [13]. Nitrates and nitrites levels The levels of nitrates and nitrites were measured by the reaction of the samples with Griess reagent. Aliquots of 50 μL were incubated with enzyme cofactors and nitrate reductase for 30 minutes at room temperature for the conversion of nitrate to nitrite. The nitrite formed was then analysed by reaction with the Griess reagent, forming a coloured compound that was measured by spectrophotometer at a wavelength of 540 nm [41].

Anexos Antioxidants Enzyme Analyses

83

The analysis of superoxide dismutase (SOD) in stomach is based on the inhibition of the reaction of the superoxide radical with adrenaline, values expressed in U/mgprot
[14].

Glutathione peroxidase (GPx) activity is based on

the consumption of NADPH in the reduction of oxidized glutathione and values were expressed in nmol/mgprot [15]. Histologycal Analyses For histological evaluation, stomach fragments slides were stained with hematoxylin and eosin and subsequently assessed by a single pathologist in blind fashion. The vessels caliber was measured in pixels. Statistical analysis All data are presented as means ± SE. Statistical significance was calculated using Graphpad Instat, version 3.0 for Windows. Variance analysis (ANOVA) and Student-Newman-Keuls were used for multiple analysis, and the level of significance was 5% (P<0.05). RESULTS Transaminase activities No significant differences were found for any of the tested parameters across the four groups sampled (Table 1). Portal Pressure Measurement There was a statistically significant increase in portal pressure values in the PPVL group as compared to SO (P<0.001), and in the NAC-treated group these values were significantly decreased (P<0.001) (Figure 1).

Anexos Stomach Lipoperoxidation Analysis

84

TBARS values in the stomach were found to be significantly increased in the PPVL as compared to the SO group (P<0.001). In the treated PPVL group those values were significantly decreased, getting close to those of the shamgroup (P<0.001) (Figure 2). Nitrates and nitrites levels NO values in the stomach were found to be significantly increased in the PPVL as compared to the SO group (P<0.01). In the NAC-treated PPVL group those values were significantly decreased (P<0.05) (Figure 3). Antioxidant enzyme activity analysis SOD activity was significantly decreased in PPVL animals as compared to SO (P<0.05), and NAC treatment caused a significant increase in SOD values as compared to the PPVL group (P<0.05) (Figure 4). GPx activity showed the same behavior as SOD, with a significant decrease in the PPVL group as compared to SO (P<0.05). NAC was able to reverse this effect, as there was a significantly increase in GPx values in NACtreated animals as compared to the values obtained for the PPVL group (P<0.05) (Figure 5). Histological Analysis Hematoxylin-eosin staining evidenced modifications in the normal architecture of the stomach, with edema and vasodilation in the PPVL group, and an attenuation of most changes in NAC-treated animals. (Figure 6A, B, C). PPVL animals presented an increase of vessels diameter (P<0,001), and NACtreated animals demonstrated a decrease of those values (P<0,001), minimizing the damage and vasodilation in this experimental model (Figure 7).

Anexos DISCUSSION

85

Portal Hypertension (PH) is associated with the development of a hyperdynamic circulation, which is characterized by vasodilation and the increase of cardiac output and/or blood flow
[17].

The development of portal-

systemic collaterals is a vascular response to the increased portal pressure. Gastroesophageal varices are the most prominent collaterals, which develop in order to diverse blood flow from the portal system and direct it to the systemic circulation
[37].

The vasodilation occurring in the stomach leads to portal

hypertensive gastropathy. Oxidative stress leads to an imbalance in the redox status of the cell, either by excessive generation of reactive oxygen species (ROS) or a decrease in antioxidant enzymes and PHG [21,24]. Nitric oxide is a central mediator of the vasoreactive and angiogenic abnormalities observed in portal hypertension. There are three known isoforms: eNOS (endothelial), iNOS (inducible), and nNOS (neuronal)
[30]. [49].The

overproduction of ROS has been implicated in PH

The increased

resistance promotes shear stress within the mesenteric circulation promoting high activity of eNOS by triggering transcription, phosphorylation by Akt, binding to Hsp90 and augment of calcium-calmodulin binding
[43,44,26,31].

However, studies have been postulating the hypothesis of vascular endothelial growth factor (VEGF) being the primary stimulus for eNOS activation, and subsequently trigger factor for the development of hyperdynamic collateral circulation [32]. iNOS is also implicated in PH, NO being an effector of the immune system
[33].

Many investigators have concluded that enhanced NO synthesis
[31,34].

contributes to the hyperdinamic circulation of PH

NO can combine with

superoxide anion (O2°-) to form peroxynitrite anion (ONOO-), nitrosothiols, nitrogen dioxide (NO2) and other nitrosant species. The excessive generation of
nitric oxide (NO) by these endothelial disorders promotes reaction to ROS, increasing,

therefore, the oxidative damage [5].

Anexos

86

Many are the experimental models used to study the complications of intra, pre- and post-hepatic PH, and PPVL is among the pre-hepatic ones [7]. In a prehepatic model, like the one used in this work, there is splenomegaly, splenic vessels dilation, and development of expressive collateral circulation that determines the emergence of gastro-esophageal varices, characterizing the portal hypertensive syndrome [18]. The fact that PPVL leads to oxidative damage was previously described by Fernando et al., who stated that ROS generation may be intimately related to the hemodynamic alterations seen in portal hypertension [4] . N-Acetylcysteine (NAC) is currently used clinically to reverse overdose by acetaminophen and also as a mucolytic agent in respiratory illnesses, to attenuate the influenza virus when started before infection, and in the treatment of pulmonary fibrosis. This is due to its ability to support endogen antioxidants and modulate nitric oxide (NO) production during stressing situations, infections, toxic aggressions, and inflammatory conditions
[6].

In disorders

where NO plays an important role, those properties are extremely important. The decrease of NO by NAC could minimize the oxidative stress in these disorders. NAC presents potent ability to interact with oxidant agents acting as scavenger of free radicals, and improves the antioxidant mechanism contributing to restore glutathione [31]. Recently, NAC was used in an experimental model of hepatic encephalopathy, a consequence of cirrhosis, with very promising results[21]. However, studies evaluating the effect of NAC on antioxidant enzymes and histological parameters using the experimental model of PPVL are not found. In the evaluation of liver enzymes, we did not observe any statistical difference between the sampled groups (Table 1). This confirms previous studies showing that PPVL does not effect any hepatocellular damage
[26],

although causing a transient reduction in the metabolic activity of the liver [35].

Anexos

87

This experimental model does not inflict cirrhosis, since according to Bosch et al, it is a experimental model of pre-hepatic portal hypertension [45, 19,20]. We observed a significant increase in portal pressure in the PPVL as compared to the SO group. This demonstrates the effectiveness of this experimental model and confirms a previous study performed in our laboratory
[22].

NAC was able to reduce portal pressure in the PPVL+NAC group (Figure

1). Experimental models of injury induced by indomethacin demonstrated vascular changes nitric oxide [6,26]. The overproduction of NO has a cytotoxic potential, enhancing mucosal injury[36]. A previous study detected enhanced NO production in this experimental model
[37], [23],

and NAC seems to be able to modulate the production of

which can be related to the induction on eNOS, nNOS

and iNOS mRNA expression, as previously described in portal hypertensive gastric mucosa[38,39]. Previous studies by our group reported that the antioxidant treatment with glutamine and quercetin were able to reduce NO production, ameliorating the gastric mucosa integrity
[37,21].

Similar results were

found in this study, in which N-Acetylcysteine was able to decrease significantly the values on PPVL+NAC group. ROS overproduction has been described as implicated in PH
[24, 21].

We

observed increased lipoperoxidation, as evaluated by TBARS, in PPVL animals, and NAC administration was associated with significant decreases in those values (Figure 2). Lipoperoxidation was evaluated previously in this model through F2–Isoprostanes measurement, and NAC treatment was able to improve this condition, just as it did in the present study [24]. The increased lipoperoxidation was accompanied by a significant decrease in SOD and GPx activities, and NAC reverted this picture, increasing them (Figures 3 and 4). SOD decrease is in line with previous studies
[37, 21,24],

and this reduction

may enhance lipid peroxidation. Along these lines, SOD decrease appears to be related to its “scavenger” action on superoxide anions
[27],

overproduced on PH.

Anexos

88

In previous studies, antioxidant treatment was able to minimize this SOD decrease, as the administration of quercetin and glutamine were able to normalize SOD activity and reduce the oxidative stress ameliorating the gastric damage induced by PH in PPVL rats [37,21]. Glutathione has been implied as possible mediator in the gastric mucosal defense against injury[25}. NAC acts as precursor of GSH, facilitating its biosynthesis
[28},

explaining GPx increase in treated animals. This drug is

defined as a precursor for the synthesis of this antioxidant enzyme[31}, and a previous study concluded that NAC reduces gastric mucosal blood flow, this effect being related to increased cysteine levels in the mucosa[25}. In the histological analysis, we observed modifications in the architecture of the gastric mucosa of PPVL rats, which showed edema and vasodilation. NAC was able to attenuate most of the histological abnormalities (Figure 6 A,B,C) by decreasing vasodilation in this experimental model (Figure 7). Different authors have demonstrated that PPVL rats show abnormalities of the gastric microvasculature similar to those observed in humans with PH [7}. Our group described previously that antioxidant treatment in experimental model of PPVL is able to ameliorate the gastric mucosa [37,21]. The decrease in GPx and SOD activities in the gastric mucosa, accompanied by increased lipoperoxidation demonstrates the presence of oxidative damage in animals submitted to this experimental model of PPVL, with hemodynamic alterations such as increased portal pressure and vasodilation/edema in the gastric mucosa. The decrease in lipoperoxidation values associated with the increase in SOD and GPx activities evidence the effectiveness of N-Acetylcisteine in portal hypertension, possibly because of its antioxidant capacity. In portal hypertensive gastropathy, it is important to define a suitable medication, able to minimize the oxidative damage and findings in the gastric mucosa. These are the main triggering events that lead to bleeding and anemia in clinical PHG, being them the major complications occurring in these patients.

Anexos

89

The use of an antioxidant therapy, capable of decreasing these complications is much valuable, in this study we observed N-Acetylcysteine acting in favor of minimizing all damage induced by PPVL in rats. Therefore, NAC can be beneficial in the treatment of portal hypertensive gastropathy. CONCLUSION In sum, NAC was able to minimize the damage to the gastric mucosa of animals submitted to the experimental model of PPVL. This antioxidant was able to ameliorate rats with portal hypertension, by decreasing portal pressure and minimizing oxidative damage evaluated through TBARS, antioxidant enzymes SOD and GPx. N-Acetylcysteine also decreased the overproduction of nitric oxide in PPVL rats and also the vessels caliber, therefore minimizing the vascular dilation in this experimental model. COMPETING INTERESTS The author(s) declare that they have no competing interests. AUTHORS’ CONTRIBUTIONS FL, CMarques, CZ, CMarroni, MIMM and NPM contributed equally to this work; NPM designed research; CZ carried out the histology; FL and CM performed the research; CMarroni and MIMM helped to draft the manuscript; FL wrote the manuscript. All authors read and approved the final manuscript. ACKNOWLEDGMENTS We thank the financial support of Clinical Hospital in which this project was submitted under number 11-0293, and Lutheran University of Brazil. We also thank the staff at Laboratory of Experimental Hepatology and Physiology and Laboratory of Oxidative Stress and Antioxidants for their excellent scientific support.

Anexos
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Anexos Figure 1

96

Effects of partial portal vein ligation (PPVL) and N-Acetylcysteine (NAC) administration on portal pressure. Sham-operated group (SO); Shamoperated treated with NAC group (SO+NAC); Partial portal vein ligation group (PPVL); Partial portal vein ligation group treated with NAC (PPVL + NAC).*P < 0.001 against sham-operated, ** P< 0.001 against PPVL.(n=6) Figure 2

Effects of partial portal vein ligation (PPVL) and N-Acetylcysteine (NAC) administration on gastric mucosa TBARS. Sham-operated group (SO); Sham-operated treated with NAC group (SO+NAC); Partial portal vein ligation

Anexos

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group (PPVL); Partial portal vein ligation group treated with NAC (PPVL + NAC). *P < 0.001 against sham-operated, ** P< 0.001 against PPVL. (n=6) Figure 3

Effects of partial portal vein ligation (PPVL) and N-Acetylcysteine (NAC) administration on nitrates and nitrites level. Sham-operated group (SO); Sham-operated treated with NAC group (SO+NAC); Partial portal vein ligation group (PPVL); Partial portal vein ligation group treated with NAC (PPVL + NAC). *P < 0.01 against sham-operated, ** P< 0.05 against PPVL. (n=6) Figure 4

Anexos

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Effects of partial portal vein ligation (PPVL) and N-Acetylcysteine (NAC) administration on gastric mucosa SOD enzyme. Sham-operated group (SO); Sham-operated treated with NAC group (SO+NAC); Partial portal vein ligation group (PPVL); Partial portal vein ligation group treated with NAC (PPVL + NAC). *P < 0.05 against sham-operated, ** P< 0.05 against PPVL. (n=6) Figure 5

Effects of partial portal vein ligation (PPVL) and N-Acetylcysteine (NAC) administration on gastric mucosa GPx enzyme. Sham-operated group (SO); Sham-operated treated with NAC group (SO+NAC); Partial portal vein ligation group (PPVL); Partial portal vein ligation group treated with NAC (PPVL + NAC). *P < 0.05 against sham-operated, ** P< 0.05 against PPVL. (n=6) Figure 6

Anexos

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Effects of partial portal vein ligation (PPVL) and N-Acetylcysteine (NAC) administration on gastric mucosa histology. A: SO; B: PPVL; C: PPVL+NAC. Magnification of 40X. SM: submucosae, MM: muscular mucosa, G: glandular tissue. Hematoxylin-eosin histology evidenced modifications of the normal architecture, with vasodilation in the gastric PPVL group, pointed by the arrows. NAC was able to ameliorate tissue integrity by minimizing vasodilation. Figure 7

Effects of partial portal vein ligation (PPVL) and N-Acetylcysteine (NAC) administration on vessels caliber. Sham-operated group (SO); Partial portal vein ligation group (PPVL); Partial portal vein ligation group treated with NAC (PPVL + NAC). *P < 0.001 against sham-operated, ** P< 0.001 against PPVL.

Anexos 100

Table 1 Effects of partial portal vein ligation (PPVL) and NAcetylcysteine (NAC) administration on serum AST, ALT and FA activities. Aspartate Aminotransferase (AST); Alanine Aminotransferase (ALT); Alkaline Phosphatase (FA); Sham-operated group(SO); Sham-operated treated with NAC group (SO+NAC); Partial portal vein ligation group (PPVL), Partial portal vein ligation group treated with NAC (PPVL + NAC). There was no statistic difference between the sampled groups.