UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Suscetibilidade in vitro e in vivo da terbinafina, itraconazol, caspofungina, ibuprofeno e fluvastatina, em combinações duplas e triplas, frente a Pythium insidiosum
Juliana Siqueira Argenta
PORTO ALEGRE 2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Suscetibilidade in vitro e in vivo da terbinafina, itraconazol, caspofungina, ibuprofeno e fluvastatina, em combinações duplas e triplas, frente a Pythium insidiosum
Autor: Juliana Siqueira Argenta Tese apresentada como requisito para obtenção do grau de Doutor em Ciências Veterinárias, na área de Microbiologia, especialidade em Micologia. Orientador: Prof. Dr. Laerte Ferreiro
PORTO ALEGRE 2012

Juliana Siqueira Argenta
SUSCETIBILIDADE IN VITRO E IN VIVO DA TERBINAFINA, ITRACONAZOL, CASPOFUNGINA, IBUPROFENO E FLUVASTATINA, EM COMBINAÇÕES DUPLAS E TRIPLAS, FRENTE A Pythium insidiosum
Aprovada em 29 MARÇO 2012
APROVADA POR: ________________________________ Prof. Dr. Laerte Ferreiro Orientador e Presidente da Comissão
_________________________________ Prof. Dr. Sandro Antonio Pereira Membro da Comissão
__________________________________ Prof. Dr. Daniela Isabel Brayer Pereira Membro da Comissão
___________________________________ Prof. Dr. Luiz Carlos Severo Membro da Comissão

Dedico aos Mestres: Janio Moraes Santurio, Sydney Hartz Alves e Laerte Ferreiro.
Por todos os ensinamentos, oportunidades e confiança!

AGRADECIMENTOS
Á minha avó Maria Helena pelo amor, dedicação, apoio constante para realização deste trabalho e principalmente por acreditar em mim.
Aos meus pais, Nilia e Jânio, e meu irmão Miguel pelo incentivo, carinho e apoio para que eu aqui chegasse.
A Dra Daniela I. B. Pereira, minha sempre amiga e colega Dani, pelo companheirismo e incansável ajuda para a conclusão deste trabalho.
Aos colegas e amigos Flávio Silveira, Grazieli Maboni, Ayrton Cavalheiro, Deise Santurio, Maria Isabel Azevedo, Régis Zanette, Patrique Pereira, Érico Loretto. Muito obrigada pelo apoio, pela amizade e por todas as palavras de incentivo.
A minha nova família, Thobias, Ana, Márcio, Gabi e Juninho, pelo carinho, amizade e por tornar a minha vida melhor.
Aos novos colegas e amigos, Dr. Buzzeto, Dr. Revir, Alceu, Rogério, Bugre, Baixinha, Rosane, Gerson, Ricardo, Maria, Alemão e Casagrande, pela paciência, amizade, pelas palavras de incentivo e apoio.
Aos amigos Aline Borba e Ismael Queiroz por fazerem parte da minha história e ter tornado tudo mais divertido e descomplicado.
Aos Professores e Funcionários do PPGCV da UFRGS, por possibilitarem e facilitarem a realização do doutorado.
A CAPES, pelo apoio financeiro.

RESUMO
Pythium insidiosum, um micro-organismo do Reino Stramenopila, é o agente etiológico da pitiose em mamíferos, uma doença difícil de tratar. O presente estudo investigou a atividade inibitória in vitro da terbinafina, itraconazol, caspofungina, fluvastatina e ibuprofeno contra 15 isolados brasileiros de P. insidiosum em combinações duplas e triplas e determinou as correlações in vivo usando coelhos com pitiose experimental. Além disso, este estudo objetivou relatar o crescimento paradoxal de isolados de P. insidiosum quando submetidos a testes de suscetibilidade in vitro com caspofungina. A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada pelo protocolo M 38-A2 do Clinical and Laboratory Standards Institute, e as interações in vitro foram avaliadas usando um método de microdiluição checkerboard. Para o estudo in vivo, 20 coelhos inoculados com zoósporos de P. insidiosum foram divididos em quatro grupos: o grupo 1 foi tratado com terbinafina e itraconazol; o grupo 2 foi tratado com terbinafina, itraconazol e fluvastatina; o grupo 3 foi tratado com terbinafina e caspofungina; e o grupo 4 foi o grupo controle. As combinações de terbinafina com caspofungina ou ibuprofeno foram sinérgicas para 47% dos isolados, e antagonismo não foi observado em nenhuma das combinações duplas. As combinações triplas foram principalmente indiferentes, mas sinergismo e antagonismo também foram observados. O crescimento paradoxal foi observado em 50% dos isolados testados a concentrações acima da CIM variando de 16 a 128 mg/ml. No estudo in vivo, o aspecto histológico das lesões foi similar entre os grupos, mas o grupo 2 mostrou a menor quantidade de hifas e diferiu significativamente dos outros grupos. Os melhores resultados in vivo foram observados quando utilizada a combinação tripla de terbinafina, itraconazol e fluvastatina (grupo 2). O presente estudo foi o primeiro estudo de suscetibilidade in vitro e in vivo com P. insidiosum usando combinações de três fármacos, e o fenômeno do efeito paradoxal envolvendo oomicetos foi descrito aqui pela primeira vez.
Palavras-chave: Pythium insidiosum, terbinafina, itraconazol, caspofungina, ibuprofeno, fluvastatina, testes de suscetibilidade, efeito paradoxal, coelhos.

ABSTRACT
Pythium insidiosum, a fungus-like microorganism of the Stramenopila kingdom, is the etiological agent of pythiosis in mammals, a difficult disease to treat. The present study investigated the in vitro inhibitory activity of terbinafine, itraconazole, caspofungin, fluvastatin and ibuprofen against 15 isolates of Brazilian P. insidiosum in double and triple combinations and determined in vivo correlations using rabbits with experimental pythiosis. Furthermore, this study aimed to report the paradoxical growth of P. insidiosum strains when submitted to in vitro susceptibility tests with caspofungin. The minimal inhibitory concentration (MIC) was determined by the Clinical and Laboratory Standards Institute M 38-A2 protocol, and the in vitro interactions were evaluated using a checkerboard microdilution method. For the in vivo study, 20 rabbits inoculated with P. insidiosum zoospores were divided into four groups: group 1 was treated with terbinafine and itraconazole; group 2 was treated with terbinafine, itraconazole and fluvastatin; group 3 was treated with terbinafine and caspofungin; and group 4 was the control group. Combinations of terbinafine with caspofungin or ibuprofen were synergistic for 47% of the isolates, and antagonism was not observed in any of the double combinations. The triple combinations were mostly indifferent, but synergism and antagonism were also observed. The paradoxical growth was observed in 50% of the isolates tested at concentrations above the minimal inhibitory concentration (MIC) ranging from 16 to 128 mg/ml. In the in vivo study, the histological aspect of the lesions was similar among the groups, but group 2 showed the lowest amount of hyphae and differed significantly from the other groups. The best in vivo results were observed using the triple combination of terbinafine, itraconazole and fluvastatin (group 2). The present study was the first study of in vitro and in vivo susceptibility of P. insidiosum using combinations of three drugs, and the phenomenon of paradoxical effect involving oomycetes was described here for the first time.
Keywords: Pythium insidiosum, terbinafine, itraconazole, caspofungin, ibuprofen, fluvastatin, susceptibilities tests, paradoxical effect, rabbits.

LISTA DE FIGURAS ARTIGO 2 FIGURA SUPLEMENTAR FIGURA 1- Percent variation of subcutaneous lesioned areas in rabbits experimentally inoculated with Pythium insidiosum and treated with a combination of terbinafine and itraconazole (group 1); terbinafine, itraconazole and fluvastatin (group 2); terbinafine and caspofungin (group 3), or control (group 4)………………………………………………………………………………59

LISTA DE TABELAS
ARTIGO 1 TABELA 1- Caspofungin MICs and PG characteristics of twenty clinical Pythium insidiosum isolates……......................................................................................50 ARTIGO 2 TABELA 1- In vitro susceptibility of Pythium insidiosum (n = 15) to terbinafine, itraconazole, caspofungin, ibuprofen and fluvastatin………………………….....55 TABELA 2- In vitro susceptibility of Pythium insidiosum (n = 15) to terbinafine combined with itraconazole, ibuprofen, fluvastatin or caspofungin and itraconazole combined with fluvastatin or ibuprofen…….………………………..55 TABELA 3- In vitro susceptibility of Pythium insidiosum (n = 15) against the triple combinations of terbinafine, itraconazole and fluvastatin; terbinafine, itraconazole and ibuprofen; terbinafine, itraconazole and caspofungin; and terbinafine, fluvastatin and caspofungin……………….…………………………..56

SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................... 10 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................. 15 3 ARTIGOS CIENTÍFICOS....................................................................... 47 4 DISCUSSÃO.......................................................................................... 60 5 CONCLUSÕES...................................................................................... 66
REFERÊNCIAS ............................................................. ....................... 67

1. INTRODUÇÃO

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Pythium insidiosum, classe Oomycete, é o agente etiológico da pitiose (DE COCK et al., 1987), uma doença caracterizada por lesões granulomatosas eosinofílicas, no qual em poucos casos obteve-se cura através de terapia com antifúngicos.
Destaca-se a pitiose entre as doenças emergentes que acomete o homem e os animais (SANTURIO et al., 2006). A espécie equina é vítima frequente e o Brasil, o país com o maior número de casos, sobretudo em planícies alagadiças como o Pantanal mato-grossense (LEAL et al., 2001a). As frequentes falhas terapêuticas e morbidade da doença determinam o sacrifício destes animais, resultando em prejuízos econômicos. Para o tratamento dos animais a imunoterapia tem sido encorajadora (MENDOZA et al., 2003; SANTURIO et al., 2003b), mas o grande desconhecimento deste oomiceto e de sua suscetibilidade a antifúngicos colocam a pitiose humana no grupo das micoses desconhecidas e de evolução fatal.
A pitiose é uma doença crônica, observada mais frequentemente em equinos e caninos. Casos esporádicos também tem sido relatados em bovinos, felinos (MENDONZA & NEWTON, 2005), ovinos (TABOSA et al, 2004; SANTURIO et al., 2008) e espécies não domésticas como jaguar (CAMUS et al., 2004), urso (GROOTERS, 2003) e camelo (WELLEHAN et al., 2004). No homem, é uma enfermidade de prognóstico desfavorável, sendo comum no sudeste da Ásia (IMWIDTHAYA, 1994 a,b).

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No Brasil, a pitiose foi descrita em equinos, bovinos, ovinos e caninos, porém a maioria dos casos relatados corresponde a lesões cutâneas em equinos. A primeira descrição de pitiose equina ocorreu no Rio Grande do Sul (SANTOS & LONDERO, 1974). Desde então, vários relatos da doença em diferentes estados do Brasil comprovam a existência da pitiose equina em todo o país (SANTOS et al., 1987; MEIRELES et al., 1993; TÚRY & COROA, 1997; MONTEIRO, 1999; TABOSA et al., 1999; RODRIGUES & LUVIZOTTO, 2000; SANAVRIA et al., 2000; LEAL et al., 2001a; SALLIS et al, 2003; REIS et al., 2003; HEADLEY & ARRUDA, 2004).
A doença é progressiva, levando o animal ao emagrecimento e à morte em 100% dos casos se não tratados. De acordo com MILLER (1981), o caráter progressivo da enfermidade sugere uma resposta imunológica inadequada ou um bloqueio da mesma, pois mesmo as hifas sendo antigênicas, não são completamente reconhecidas pelo hospedeiro, devido à marcante reação inflamatória. Uma vez dentro do hospedeiro, P. insidiosum induz a uma reação granulomatosa eosinofílica com células gigantes, mastócitos, macrófagos e poucos linfócitos. Os eosinófilos na tentativa de fagocitar o micro-organismo são degranulados sobre a hifa. Em equinos, esta reação é extremamente pronunciada, o que leva a formação de massas firmes semelhantes a corais, conhecidas como kunkers, compostas por eosinófilos degranulados intercalados por hifas viáveis de P. insidiosum (MENDONZA et al., 1996). Acredita-se que essas estruturas ajudem na proteção do fungo frente às células de defesa do hospedeiro, pois o agente fica preservado dentro do material eosinofílico. Sendo assim, esta estratégia pode proteger o patógeno do reconhecimento pelo sistema imunológico, assegurando

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sua presença nos tecidos infectados (MILLER, 1981; MENDONZA et al., 1992a; MENDONZA et al., 2003).
O tratamento da pitiose em animais e humanos é dificultado pelas peculiaridades do agente etiológico, notadamente a ausência de ergosterol na membrana plasmática, componente alvo de ação da maioria dos fármacos antifúngicos. Por isso, os fármacos antifúngicos são ineficientes e a maioria dos animais atingidos não sobrevive em decorrência da infecção (FOIL, 1996; GROOTERS, 2003). Mesmo assim, várias tentativas de tratamento foram realizadas utilizando fármacos antifúngicos isoladamente como anfotericina B, cetoconazol, miconazol, fluconazol, itraconazol e compostos iodínicos com resultados desanimadores. Entretanto, algumas tentativas de terapia com fármacos que atuam na síntese do ergosterol tem demonstrado cura clínica em poucos cães e em um paciente humano com pitiose (SHENEP et al., 1998; GROOTERS, 2003).
Miller (1981) utilizou um imunoterápico produzido a partir de hifas inativadas e sonicadas de P. insidiosum e obteve cura em 53% dos animais tratados, observando um aumento deste índice quando a imunoterapia foi precedida por cirurgia. Em contrapartida aos resultados obtidos em equinos, a imunoterapia em cães e gatos tem sido desapontadora. Somente 33% dos caninos e nenhum dos gatos tratados responderam ao tratamento (MENDONZA & NEWTON, 2005).
Embora os índices de cura obtidos com a utilização do imunoterápico sejam bons e apresente baixo custo, existem muitos casos não responsivos a imunoterapia. Associado a este fato, a maioria dos fármacos antifúngicos disponíveis atuam inibindo a síntese do ergosterol, ausente na membrana do P. insidiosum, o que restringe o número de fármacos que podem ser utilizadas para o

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tratamento da enfermidade. Nestas situações, há necessidade de uma alternativa terapêutica eficaz. Tendo em vista a quantidade de agentes antifúngicos disponíveis e os diversos efeitos colaterais e toxidez provocados pelos mesmos, uma opção é a terapêutica combinada, utilizando associações duplas ou triplas entre medicamentos antifúngicos e não antifúngicos (GALGÓCZY et al., 2011).
A terapia combinada constitui-se numa alternativa à terapia individual, especialmente para pacientes com infecções invasivas difíceis de tratar. As associações de antifúngicos de diferentes classes é um caminho a ser percorrido pela pesquisa; na pitiose humana, há relatos de sucesso pela combinação terbinafina e itraconazol (SHENEP et al., 1998). As demais associações, envolvendo fármacos mais modernos estão aguardando estudos que demonstrem seus potenciais.
A terbinafina pertence ao grupo das alilaminas e atua especificamente em um estágio precursor de biossíntese do ergosterol, inibindo a enzima esqualenoepoxidase (GOSBELL et al., 2003). O itraconazol e outros azólicos atuam reduzindo a síntese de ergosterol através da inibição do citocromo P450 (GOSBELL et al., 2003). Ambas as enzimas estão envolvidas na rota de biossíntese do ergosterol na membrana celular fúngica, portanto, a combinação de terbinafina e azólicos poderia proporcionar sinergismo pelo bloqueio sequencial desta rota (KOWALSKY & DIXON, 1991, MELETIADIS et al., 2003).
A caspofungina é um antifúngico derivado das equinocandinas, cujo mecanismo de ação baseia-se na inibição não competitiva da enzima β (1,3) -Dglucana sintetase. Desta forma, impede a síntese de β-glucanas da parede celular, componente essencial para integridade estrutural e estabilidade osmótica das

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células fúngicas. A associação de outros fármacos provavelmente potencialize a ação da caspofungina no tratamento da pitiose, uma vez que este oomiceto apresenta grande quantidade de β glucana na sua parede celular (GROOTERS, 2003).
Ibuprofeno é um anti-inflamatório não esteroidal que tem mostrado atividade antifúngica contra Candida albicans e efeito sinérgico sobre isolados de P.insidiosum quando combinados com antifúngicos (CAVALHEIRO et al., 2009b). A fluvastatina, uma estatina sintética, é um fármaco redutor de colesterol que age inibindo uma enzima limitante na via de biossíntese de colesterol (CHIN et al., 1997). Estudos tem mostrado sinergismo entre estatinas e azóis contra Candida spp., Cryptococcus neoformans e zigomicetos (QIAO et al., 2007).
Na busca por novas opções terapêuticas para pitiose, este estudo teve como objetivos:
- Avaliar a suscetibilidade in vitro do P. insidiosum aos antifúngicos terbinafina, itraconazol e caspofungina; ao anti-inflamatório ibuprofeno; e ao hipocolesterolemiante fluvastatina;
- Avaliar a suscetibilidade in vitro do P. insidiosum frente às associações duplas e triplas destes fármacos;
- Determinar a correlação in vivo dessas associações utilizando coelhos com pitiose experimental.

2. REVISÃO DA LITERATURA

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A pitiose é uma enfermidade crônica, piogranulomatosa que atinge principalmente equinos, caninos, bovinos e o homem. Ocorre em áreas tropicais, subtropicais ou temperadas (MEIRELES et al., 1993; MENDOZA et al., 1996), sendo causada pelo oomiceto aquático Pythium insidiosum (DE COCK et al., 1987), atualmente classificado no Reino Stramenopila, Classe Oomycetes, Ordem Pythiales, Família Pythiaceae, Gênero Pythium (MENDONZA & NEWTON, 2005).
A espécie equina é a mais atingida por este agente, principalmente nas formas cutânea e subcutânea (MENDOZA et al., 1996). A enfermidade nestes animais caracteriza-se pela formação de granulomas eosinofílicos, com presença de massas necróticas chamadas de kunkers (MENDOZA & ALFARO, 1986; MEIRELES et al., 1993). A segunda espécie mais atingida é a canina e as infecções manifestam-se pela formação de piogranulomas gastrointestinais e cutâneos (MILLER et al., 1983; FOIL et al., 1984; SMITH et al., 1989; HOWERTH et al., 1989; FISCHER et al., 1994; GROOTERS, 2003). Também tem sido descrita como causa incomum de lesões cutâneas e subcutâneas em gatos (BISSONNETE et al., 1991; GROOTERS, 2003; RAKICH et al., 2005), bovinos (MILLER et al., 1985; SANTURIO et al., 1998; PÉREZ et al., 2005) e ovinos (TABOSA et al., 2004; SANTURIO et al., 2008). Em humanos, a doença é comum no sudeste da Ásia, principalmente na Tailândia, apresentando-se nas formas subcutânea, oftálmica e sistêmica, sendo que as formas cutâneas e sistêmicas estão associadas a α e βtalassemia, comuns nessa região (IMWIDTHAYA, 1994a,b). Nas espécies não

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domésticas, P. insidiosum foi reconhecido como causa de doença pulmonar primária num jaguar (Pantera onca) da América Central (CAMUS et al., 2004), causando lesões cutâneas e gastrintestinais em um urso de zoológico (GROOTERS, 2003) e lesão mandibular subcutânea em um camelo (WELLEHAN et al., 2004). Pesavento et al. (2008) publicou o primeiro relato deste oomiceto como causador de pitiose cutânea em pássaros.
Estudos taxonômicos, baseados em análises de sequenciamento de gene do RNA ribossomal de P. insidiosum, confirmaram que os membros da classe Oomycetes são filogeneticamente distantes dos membros do Reino Fungi (KWONCHUNG, 1994). A distância taxonômica entre os oomicetos e os fungos está retratada ao nível celular através de diferenças na parede e composição da membrana. A quitina, um componente essencial da parede celular fúngica, está geralmente ausente na parede celular dos oomicetos, no qual aparecem como componentes predominantes, celulose e β-glucana (GROOTERS, 2003). Também os oomicetos diferem dos fungos quanto ao papel do ergosterol na membrana celular, ou seja, não sendo o principal esteróide. No entanto, espécies dos gêneros Pythium, Lagenidium, e Phytophthora incorporam esteróides do ambiente (esteróides auxotróficos), ao contrário do que ocorre com os fungos. De acordo com Grooters (2003), os esteróides são importantes para produção de estruturas reprodutivas in vitro, não sendo necessários para o crescimento vegetativo.
O gênero Pythium caracteriza-se principalmente por apresentar parede celular composta de β-glucanas, celulose e hidroxipolina; talo diplóide; mitocôndria com crista tubular; reprodução assexuada com produção de zoósporos biflagelados;

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reprodução sexuada oogâmica (MOORE-LANDECKER, 1996; ALEXOPOULOS et al., 1996). Esse gênero possui mais de 120 espécies distribuídas no mundo inteiro, sendo a maioria habitante do solo e patógenos de plantas, mas apenas a espécie P. insidiosum é conhecida como patógeno de mamíferos (LEAL et al., 2001b).
A pitiose ocorre em regiões de clima tropical, subtropical e temperado, tendo sido relatada na Argentina, Austrália, Brasil, Colômbia, Costa Rica, Estados Unidos, Haiti, Índia, Indonésia, Japão, Nova Zelândia, Papua-Nova Guiné, Tailândia (CHAFFIN et al., 1995; FOIL, 1996; MENDOZA et al., 1996; MENDONZA & NEWTON 2005), Venezuela (PÉREZ et al, 2005) e África (RIVIERRE et al., 2005). Não há predisposição por sexo, idade ou raça e a fonte de infecção são os zoósporos ambientais, não havendo relatos de transmissão direta entre os animais ou entre animais e o homem (MENDOZA et al., 1996). Comumente, observa-se que os animais afetados permanecem por longos períodos em contato com águas paradas em lagos, açudes ou locais pantanosos. Provavelmente, altas temperaturas e precipitação pluviométrica mantêm as condições necessárias para reprodução do P. insidiosum (CHAFIN et al., 1995).
Segundo Miller & Campbell (1982a), para haver a produção de zoósporos são necessárias temperaturas entre 30º e 40ºC e o acúmulo de água. Estas condições parecem essenciais, uma vez que a grande maioria dos casos de pitiose foi observada durante ou após a estação chuvosa. Essas características podem ser observadas no Pantanal Matogrossense, onde a maioria dos casos de pitiose equina foi registrada entre os meses de fevereiro e maio (verão-outono), período que corresponde ao ápice das cheias (LEAL et al., 2001a), e na Paraíba onde a

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maioria dos casos relatados foi registrada sete a dez meses após o início das chuvas na região (TABOSA et al., 1999).
Miller (1983) propôs um ciclo que se baseia na colonização de plantas aquáticas e posterior formação de zoosporângios. Os zoósporos livres na água movimentam-se até encontrar outra planta (ou animal), onde se encistam e emitem tubos germinativos, dando origem a um novo micélio e completando seu ciclo.
Análises in vitro demonstraram que a quimiotaxia dos zoósporos por pelos, tecido animal e vegetal é atribuída a substâncias presentes nessas estruturas. Uma substância amorfa é liberada pelo zoósporo após o seu encistamento, sendo provavelmente produzida em resposta ao fator quimiotáxico do hospedeiro. Segundo os autores, essa substância, que pode ser uma glicoproteína, age como um adesivo para ligar o zoósporo à superfície do hospedeiro, permitindo a formação de tubo germinativo, constituindo-se num importante fator de virulência do patógeno (MENDOZA et al., 1993). Essas observações sustentaram a teoria de infecção, sugerindo que os cavalos em contato com águas contaminadas poderiam atrair os zoósporos, os quais germinariam a partir de uma pequena lesão cutânea (MILLER, 1983; MENDOZA et al., 1993). Os estudos de Ravishankar et al. (2001) demonstraram que os ápices das hifas de P. insidiosum exerceram forças de 6,9µN quando testado contra diferentes superfícies, incluindo pele humana e animal. Porém, observaram que esta força não foi suficiente para penetrar a pele intacta, mostrando, portanto, que este patógeno requer lesões prévias na pele para infectar os tecidos do hospedeiro. Os autores demonstraram também, que este microorganismo pode reduzir a resistência tecidual através da secreção de proteases.

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Resultados similares foram encontrados por MacDonald et al. (2002). Entretanto, Santurio et al. (1998) sugeriram a possibilidade de penetração dos zoósporos através dos folículos pilosos, baseados na detecção de hifas no interior do folículo de bovinos infectados naturalmente e no fato do quimiotaxismo ser mais ativo na região do pelo encontrada dentro do folículo piloso. Essa observação pode questionar a necessidade de lesão na pele para que ocorra a germinação dos zoósporos. Por outro lado, em relatos acompanhados no Brasil, foi possível detectar diferenças na suscetibilidade de equinos à infecção. Comparando-se com os dados de pitiose humana, no qual a maior parte dos casos ocorre em indivíduos talassêmicos, pode-se suspeitar da presença de alguma(s) característica(s) que torne alguns animais mais suscetíveis (SANTURIO et al., 2003a). Segundo Foil (1996), P. insidiosum é considerado um micro-organismo patogênico, uma vez que a supressão imunológica não é um prérequisito aparente para a infecção.
No Brasil, a pitiose foi descrita em equinos, bovinos, ovinos e caninos, porém a maioria dos casos relatados corresponde a lesões cutâneas em equinos. O primeiro relato ocorreu no Rio Grande do Sul por Santos & Londero (1974). Desde então, há várias descrições da doença em diferentes Estados do Brasil. O Pantanal brasileiro é provavelmente o local de maior incidência e prevalência de pitiose equina do mundo (Mendoza et al., 1996). O Pantanal é uma planície inundável de aproximadamente 140.000 km2 e possui em torno de 139.760 equinos (Silva et al., 1995). Embora não exista um levantamento preciso da incidência no Brasil, a pitiose representa um problema à equinocultura, especialmente em regiões alagadiças como o Pantanal (Leal et al, 2001b).

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Não foi observada predisposição de raça, sexo ou idade nos equinos com pitiose (MENDOZA & ALFARO, 1986; CHAFFIN et al., 1995; FOIL, 1996). As lesões cutâneas são as mais frequentes e atingem principalmente as extremidades distais dos membros e porção ventral da parede tóraco-abdominal, provavelmente devido ao maior tempo de contato com águas contendo zoósporos (MILLER & CAMPBELL, 1982a; CHAFFIN et al., 1995; MENDONZA et al., 1996).
Os sinais clínicos em equinos caracterizam-se por lesões ulcerativas granulomatosas, formando grandes massas teciduais (5 a 500 mm), com bordas irregulares, de aparência tumoral e com hifas recobertas por células necróticas, que formam massas branco-amareladas semelhantes a corais, chamadas de kunkers (PEREIRA, 2008). Essas massas variam de 2 a 10 mm de diâmetro, com forma irregular, ramificada, aspecto arenoso e penetram no tecido granular, dentro de “sinus” formados ao longo do seu trajeto. O tamanho das lesões depende da sua localização e tempo de evolução da infecção, podendo apresentar secreção serosanguinolenta, mucosanguinolenta, hemorrágica e, às vezes, mucopurulenta que flui através dos “sinus”. Os animais apresentam intenso prurido e usualmente mutilam a lesão na tentativa de aliviar o desconforto. Claudicação é frequente nos cavalos atingidos nos membros (MILLER & CAMPBELL, 1982a; MEIRELES et al., 1993; CHAFFIN et al.,1995; MENDOZA et al., 1996). A maioria dos casos descritos relata apenas uma lesão em cada animal, porém podem existir lesões cutâneas multifocais, como as descritas por Miller & Campbell (1982a), Mendoza & Alfaro (1986) e Chaffin et al. (1992).

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A segunda forma mais frequente da infecção pelo P. insidiosum em equinos é a intestinal. Os casos descritos apresentaram-se como episódios de cólica, cuja causa foi a presença de massas teciduais, com diminuição e/ou obstrução do lúmen intestinal. Além da pitiose cutânea e intestinal, pitiose pulmonar foi relatada por Pecquet-Goad (1984) em um equino que apresentava tosse e descarga nasal sanguinolenta um ano após tratamento de uma lesão cutânea em um dos membros, e Reis et al. (2003), detectaram infecção generalizada em três equinos no estado de Minas Gerais, com lesões localizadas principalmente nos pulmões e fígado.
Os autores sugeriram que a disseminação do patógeno para órgãos internos seria possível em casos crônicos de pitiose. As lesões ósseas descritas na literatura referem-se a cavalos com lesões cutâneas crônicas localizadas nos membros e com grande proliferação de tecido granulomatoso. Lesões em linfonodos cervicais inferiores, inguinais e submandibulares, normalmente os responsáveis pela drenagem linfática da região afetada pela lesão cutânea, foram observadas por Connole (1973); Murray et al. (1978) e Leal et al. (1997).
A histopatologia da pele de equinos afetados revela a presença de úlceras acompanhadas por acantose, paraqueratose e papilomatose, podendo constituir-se numa hiperplasia pseudoepiteliomatosa, enquanto a derme apresenta abundantes áreas necróticas (microabscessos), com reação inflamatória composta basicamente de eosinófilos, células plasmáticas, neutrófilos, alguns linfócitos e macrófagos (MENDONZA, 1987). Segundo Miller & Campbell (1984), as lesões histológicas caracterizam-se pela formação de coágulos eosinofílicos encontrados no interior de tecido fibroso e inflamação granulomatosa. Os kunkers, observados na

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macroscopia, correspondem aos coágulos eosinofílicos que são compostos de hifas, colágeno, arteríolas e células inflamatórias, especialmente eosinófilos. Em torno das hifas, os eosinófilos encontram-se degenerados e enquanto que, em direção a periferia os grânulos tornam-se mais evidentes, sendo comum encontrarse eosinófilos intactos na periferia da lesão. A área ao redor do coágulo é composta por um espesso exsudato inflamatório composto de neutrófilos e eosinófilos, podendo apresentar ocasionalmente células gigantes e macrófagos. Já a área entre os kunkers é caracterizada por inflamação granulomatosa e granulocítica. Em lesões crônicas observa-se marcada fibrose com redução do número de células inflamatórias. A formação de depósitos eosinofílicos em torno das hifas, produzindo o fenômeno de Splendori-Hoeppli, também pode ser observada (PEREIRA et al., 2008). Hifas de Pythium spp. não coram bem em colorações de Hematoxilina e Eosina, sendo observadas como imagens negativas delimitadas por ampla bainha eosinofílica associada à parede da hifa (PEREIRA, 2008). Entretanto, em cortes corados com coloração especial de prata (Grocott), as hifas são evidenciadas na periferia dos kunkers com paredes espessas marrom-escuras, esparsamente septadas, irregularmente ramificadas (normalmente em ângulo reto) e medindo de 2 a 6 µm de diâmetro (CHAFFIN et al., 1995; FOIL, 1996).
Em bovinos, a pitiose foi descrita na região da Louisiana (EUA) afetando seis animais (MILLER et al., 1985), na região do Pantanal Matogrossense (Brasil) em dois bovinos (SANTURIO et al., 1998) e na Venezuela, onde se observou a ocorrência de pitiose enzoótica em 63 bovinos (PÉREZ et al., 2005). Em todos os casos havia a presença de lesões cutâneas, geralmente localizadas nos membros,

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caracterizadas por ulcerações, espessamento da derme e edema na região afetada. Prurido e claudicação foram observados nos casos descritos por Pérez et al. (2005). Em nenhum dos relatos observou-se presença de kunkers e a idade dos animais afetados variou entre três meses e um ano de idade. Histologicamente, as lesões apresentaram-se como granulomas dermais multifocais, rodeados por tecido conjuntivo fibroso e presença de hifas ramificadas no centro dos granulomas. A reação de Splendore-Hoeppli foi observada nos casos descritos por Miller et al. (1985) e Pérez et al. (2005). Apenas o relato de Santurio et al. (1998) mencionou a cura espontânea das lesões.
Nos ovinos a primeira descrição de pitiose foi relatada por Tabosa et al. (2004) afetando dois rebanhos no nordeste brasileiro, no estado da Paraíba. Os animais afetados apresentaram lesões ulcerativas úmidas ou secas, localizadas nos membros, regiões abdominal e pré-escapular, sem presença de kunkers. P. insidiosum foi isolado das lesões cutâneas e o diagnóstico foi confirmado por imunohistoquímica. O segundo relato de pitiose em ovinos também foi reportado no Brasil, sendo o primeiro caso de rinite granulomatosa por P. insidiosum descrito nesta espécie (SANTURIO et al., 2008). A enfermidade ocorreu em quatro ovinos da raça Santa Inês e foi caracterizada por nodulações e necrose nasal, dispnéia e epistaxe intermitente (SANTURIO et al., 2008).
No Brasil, o primeiro caso de pitiose canina foi descrito em uma fêmea com lesão cutânea no membro posterior direito (LARSSON et al., 1997). Posteriormente, dois casos de pitiose gastrointestinal foram descritos no Rio Grande do Sul por RietCorrea et al. (1998) e Rech et al. (2004). Os caninos são a segunda espécie mais

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atingida pela pitiose, também nas formas cutânea e gastrointestinal. A forma gastrointestinal é a mais comum e manifesta-se com distúrbios digestivos como vômito, anorexia crônica, perda de peso, diarréia e presença de massas nodulares à palpação abdominal (MILLER et al., 1983; MILLER, 1985; BENTINCK-SMITH et al., 1989; FISCHER et al., 1994; RIET-CORREA et al., 1998; HELMAN & OLIVER, 1999; LILJEBJELKE et al., 2002; GROOTERS, 2003, MENDONZA et al., 2005). Os cães afetados são normalmente oriundos de regiões rurais ou estiveram, esporadicamente, em locais alagados como açudes e banhados (FOIL et al., 1984; FISCHER et al., 1994; HELMAN & OLIVER, 1999; DYKSTRA et al., 1999).
As lesões gastrointestinais caracterizam-se pela formação de grandes massas nas paredes do estômago e intestino com ulceração variável da mucosa (MILLER et al., 1983; MILLER, 1985; BENTINCK-SMITH et al., 1989; FISCHER et al., 1994; LILJEBJELKE et al., 2002; RECH et al., 2004). Miller (1985) descreveu que em lesões crônicas, o pâncreas, útero, linfonodos mesentéricos e vasos linfáticos também podem ser afetados. Histologicamente, as lesões localizam-se preferencialmente na mucosa e submucosa, sendo compostas por inflamação granulomatosa e piogranulomatosa com áreas de necrose, intenso infiltrado eosinofílico e presença de hifas nos focos necróticos (MILLER et al., 1983; MILLER, 1985; BENTINCK-SMITH et al., 1989; FISCHER et al., 1994; LILJEBJELKE et al., 2002; RECH et al., 2004, MENDONZA et al., 2005), podendo em algumas ocasiões observar a reação de Splendori-Hoeppli (FISCHER et al., 1994). As lesões cutâneas geralmente se localizam nas extremidades, base da cauda, períneo e face, aumentam rapidamente de tamanho, ulceram e apresentam múltiplos tratos

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fistulosos (THOMAS & LEWIS, 1998). Microscopicamente, as lesões apresentam-se como dermatite granulomatosa a piogranulomatosa ulcerativa, contendo áreas de necrose infiltrada por neutrófilos e macrófagos e granulomas eosinofílicos (FOIL et al., 1984; ENGLISH & FROST, 1984; HOWERTH et al., 1989; DYKSTRA et al., 1999).
Em felinos há poucas descrições. Um relato refere-se a uma infecção nasal e retrobulbar, sem envolvimento de órgãos internos, cujo diagnóstico baseou-se em imunohistoquímica, sorologia (imunodifusão) e isolamento do agente. A histopatologia revelou o acúmulo de eosinófilos, macrófagos, grandes linfócitos e presença de hifas largas e ramificadas (BISSONNETTE et al., 1991). Thomas & Lewis (1998) relataram quatro casos de pitiose cutânea com lesões nos membros, abdômen e região inguinal. Estes mesmos autores descreveram lesões com manifestações clínicas diferentes em dois gatos, caracterizadas por grandes massas subcutâneas na região distal dos membros, sem envolvimento cutâneo. Grooters (2003) observou, desde 1999, a ocorrência de dez casos de pitiose subcutânea afetando gatos entre quatro meses e nove anos de idade. As lesões caracterizavam-se por massas subcutâneas, algumas altamente invasivas, localizadas na região inguinal, base da cauda e região periorbital. Em alguns casos, as lesões eram nodulares e supurativas e em outros se assemelhavam a placas ulceradas localizadas nas extremidades. Rakich et al. (2005) relataram dois casos de pitiose gastrointestinal em gatos nos EUA. Os animais apresentavam perda de peso e vômito, associados a uma massa palpável na região abdominal. A avaliação histopatológica revelou uma enterite granulomatosa eosinofílica, envolvendo a

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camada muscular e serosa, com áreas multifocais de necrose, no interior das quais havia a presença de hifas de P. insidiosum.
No homem existem quatro diferentes formas clínicas de pitiose: vascular, ocular, cutânea / subcutânea e formas diversas, correspondendo por 59, 33, 5, e 3% de todos os casos, respectivamente (SUDJARITRUK & SIRISANTHANA, 2011). A forma cutânea caracteriza-se pelo desenvolvimento de lesões subcutâneas com achados histopatológicos de reação granulomatosa, infiltração difusa e edema da parede dos vasos. Já a forma vascular, é caracterizada pelo desenvolvimento de arterite crônica, trombose arterial e gangrena, atingindo geralmente a extremidade dos membros inferiores. Esta forma é encontrada em pacientes talassêmicos e geralmente leva a amputação do membro afetado (PEREIRA, 2008). A forma ocular manifesta-se como ceratite, podendo ou não estar associada a talassemia. Nesta forma, os pacientes usualmente terminam por realizar ceratoplastia, evisceração ou enucleação (IMWIDTHAYA, 1995; PRASERTWITAYAKIJ et al., 2003). Nestes casos, tanto o diagnóstico precoce, como o adequado tratamento médico e cirúrgico são cruciais para um bom prognóstico (SUDJARITRUK & SIRISANTHANA, 2011).
Os primeiros casos de pitiose humana foram relatados na Tailândia (MENDOZA et al., 1996), sendo o país com o maior número de casos descritos. Prasertwitayakij et al. (2003) realizaram uma revisão na literatura, e encontraram 32 casos de pitiose humana, sendo 25 relatados na Tailândia e os demais nos EUA, Austrália, Haiti, Malásia e Nova Zelândia. Na maioria dos casos descritos os pacientes eram agricultores e apresentavam talassemia. Nove pacientes desenvolveram a forma de ceratite com ulceração da córnea, sendo realizada

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ceratoplastia em todos os afetados. Cinco apresentaram a forma subcutânea e foram submetidos à excisão cirúrgica da lesão e tratamento com antifúngicos, respondendo bem a terapia. Dezessete pacientes tailandeses desenvolveram a forma sistêmica, dos quais 16 sofreram amputação do membro afetado e oito vieram a óbito. Na Tailândia, observa-se que dois fatores contribuem para importância da pitiose humana: a prevalência da ά e ß talassemia e presença de grandes áreas alagadiças utilizadas para agricultura (TRISCOTT et al., 1993; IMWIDTHAYA, 1994b). Além dos casos de ceratite incluídos na revisão de Prasertwitayakij et al. (2003), outros relatos foram descritos na Tailândia por Imwidthaya (1995) e Krajaejun et al. (2004). Nos EUA, Shenep et al. (1998) relataram a ocorrência de ceratite causada por P. insidiosum em uma criança, que obteve cura após tratamento com antifúngicos. No Brasil a pitiose teve seu primeiro relato em humanos no ano de 2005, na forma cutânea (BOSCO et al., 2005).
Até o presente momento, não foi possível reproduzir-se a enfermidade através de infecção experimental nas espécies infectadas naturalmente. Miller & Campbell (1983a) demonstraram a suscetibilidade de coelhos como modelo experimental para a pitiose. A inoculação subcutânea de água rica em zoósporos produziu nódulos que evoluíram para fibrogranulomas eosinofílicos com características similares à infecção natural dos equinos, havendo o isolamento de P. insidiosum de algumas lesões. Após 20-30 dias de inoculação subcutânea dos zoósporos observaram abscedação progressiva, porém não ocorreram ulcerações comparáveis com a doença natural nos equinos, e tampouco a formação de kunkers (MILLER & CAMPBELL, 1983a). No entanto, na avaliação leucocitária, o

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quadro da pitiose em coelhos foi semelhante aos equinos, ou seja, ocorreu progressiva leucocitose com moderada neutrofilia e leve monocitose (MILLER & CAMPBELL, 1983a,b). A histologia das lesões revelou uma área central de necrose contendo eosinófilos e hifas fúngicas na periferia, delimitada por tecido conjuntivo, o qual se encontrava envolvido externamente por uma bainha assimétrica de macrófagos, células epitelióides e algumas células gigantes (MILLER & CAMPBELL, 1983a). Os trabalhos de alguns pesquisadores como Santurio et al. (2003b), que utilizaram coelhos inoculados com P. insidiosum para avaliar três diferentes formulações usadas para imunoterapia, Leal et al. (2002), que avaliaram a resposta sorológica de coelhos imunizados com antígenos de P. insidiosum, e Pereira et al. (2008), que comparam a terapia antifúngica e a imunoterapia, comprovam que esta espécie serve como modelo experimental, tanto para estudos sorológicos como para avaliação de agentes antifúngicos contra P. insidiosum. Em resumo, a pitiose experimental é possível apenas em coelhos (GAASTRA et al., 2010).
O diagnóstico presuntivo de pitiose é realizado levando-se em consideração a epidemiologia, sinais clínicos e aspectos macro e microscópicos das lesões. O isolamento e identificação do agente são de grande valor para o diagnóstico definitivo e diferencial, uma vez que a pitiose em equinos deve ser diferenciada de habronemíase cutânea, zigomicoses (especialmente conidiobolomicose e basidiobolomicose), neoplasias, como carcinoma de células escamosas e sarcóide, tecido de granulação exuberante e granulomas bacterianos (CHAFFIN et al., 1995). Já em caninos, o diagnóstico diferencial deve incluir infecções causadas por zigomicetos e oomicetos do gênero Lagenidium (GROOTERS,

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2003).
Embora o isolamento e identificação de P. insidiosum constituam uma importante ferramenta para o diagnóstico, em algumas ocasiões o isolamento não ocorre e a identificação das espécies de Pythium não é uma tarefa fácil, pois baseia-se principalmente nas características morfológicas dos zoosporângios, zoósporos, oogônia e anterídio (ALEXOPOULOS et al., 1996; MOORELANDECKER, 1996). O isolamento pode ser feito nos meios de cultivo como ágar Sabouraud dextrose, caldo Sabouraud, ágar sangue, ágar infusão-cérebrocoração (BHI) e ágar farinha de milho (CMA) (CHAFFIN et al., 1995). Pedaços pequenos de tecido fresco, previamente lavados em solução salina ou água destilada estéril, são distribuídos diretamente na superfície do ágar, devendo ficar incubado a 37ºC, por 24 – 48 horas (MENDONZA et al., 1996). A identificação é realizada através do aspecto da colônia e da característica das hifas. As colônias apresentam-se submersas no ágar, com curto micélio aéreo, apresentando coloração hialina. Microscopicamente, observam-se hifas hialinas, cenocíticas com 4-10 µm de diâmetro, ocasionalmente septadas, apresentando ramificações em ângulo reto (DE COCK et al., 1987). A produção de zoosporângios e zoósporos deve ser observada para identificação final de P. insidiosum. Para obtenção de zoósporos in vitro, pedaços de folhas de grama previamente esterilizados, são distribuídos sobre cultivos de P. insidiosum em ágar água a 2% e incubados a 37ºC por 24 horas. Posteriormente, os pedaços de folhas infectados são transferidos para uma solução de sais minerais diluída a 1%. Cerca de 2-4 horas de incubação a 37ºC, zoosporângios contendo zoósporos móveis são observados

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nos bordos terminais das folhas (MENDONZA & PRENDAS, 1988; CHAIPRASERT et al., 1990; GROOTERS, 2003). Os zoósporos tem forma reniforme e apresentam um flagelo anterior (que gera o impulso) e um flagelo posterior (responsável pela direção) originados de um sulco ventral ou lateral. Uma vez liberados das vesículas, nadam em movimentos espirais ou helicoidais em diferentes direções, por aproximadamente quinze minutos. Após esse período, se encistam tornando-se globosos e emitem tubo germinativo (MENDONZA et al., 1993; GROOTERS, 2003).
Técnicas sorológicas foram desenvolvidas para o diagnóstico precoce e monitoramento da resposta imunológica em equinos com pitiose. Miller & Campbell (1982b) desenvolveram as técnicas de imunodifusão em gel de ágar (ID), fixação do complemento (FC) e um teste de hipersensibilidade intradérmica (TI), para diagnosticar e avaliar a resposta imune humoral e celular de cavalos com pitiose. Os testes realizados em cavalos com pitiose clínica comprovada, diagnosticaram positivamente 100% (ID), 82% (FC) e 64% (TI) dos casos. Esses dados comprovaram que o teste de ID apresentava alta sensibilidade e especificidade para a detecção de anticorpos anti-P. insidiosum. Resultados similares foram obtidos por Mendonza & Alfaro (1986). Mendonza et al. (1986) avaliando três diferentes antígenos utilizados para o teste de ID, demonstraram melhor sensibilidade e especificidade quando o antígeno foi produzido a partir de filtrados de cultura. O teste de FC foi utilizado somente na Austrália, pois além da menor sensibilidade e especificidade que a ID, é um teste difícil de realizar e requer pessoal experiente para seu desenvolvimento (MENDOZA et al, 1996). Da

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mesma forma, Imwidthaya & Srimuang (1989) demonstraram a sensibilidade e especificidade da ID para o diagnóstico e monitoramento da pitiose no homem. Embora este teste identifique anticorpos no soro da maioria dos equinos e humanos infectados, falha na detecção de anticorpos em caninos com doença ativa (GROOTERS, 2003). Similarmente, Pérez et al. (2005) ao utilizar o teste de ID para diagnóstico de pitiose em bovinos, constataram que apenas 22,8% dos animais infectados demonstraram reações positivas, sugerindo a baixa sensibilidade desta técnica para o diagnóstico da doença nesta espécie.
Segundo Mendonza et al. (2005), um importante passo para identificação de P. insidiosum em amostras histopatológicas foi o desenvolvimento das técnicas de anticorpos fluorescentes por Mendonza et al. (1987) e imunoperoxidase por Brown & Roberts (1988). O teste de imunofluorescência demonstrou especificidade na detecção de hifas nos tecidos de felinos, caninos e humanos, porém em equinos, a fluorescência uniforme observada, devido à liberação de antígenos solúveis, impediu a utilização deste teste como diagnóstico nesta espécie (MENDONZA et al., 1996).
Alguns autores citaram que a técnica de imunoperoxidase tem sido utilizada no diagnóstico de pitiose em equinos, caninos, bovinos, ovinos e humanos (BROWN & ROBERTS, 1988; HOWERTH et al., 1989; TRISCOTT et al., 1993; FISCHER et al., 1994; PURCELL et al., 1994; HELMAN & OLIVER, 1999; SANTURIO et al., 1998; LILJEBJELKE et al., 2002; JAEGER et al., 2002; TABOSA et al., 2004). Entretanto, Grooters et al. (2003) mostraram reação cruzada em caninos infectados por Lagenidium sp.

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Mendoza et al. (1997) desenvolveram um teste de ELISA para o sorodiagnóstico de pitiose em humanos e animais, utilizando antígeno solúvel de hifas sonicadas. Amostras de soro de humanos e animais saudáveis e com pitiose clínica foram testadas e os resultados comparados com o teste de ID. Os dados deste trabalho demonstraram que o teste de ELISA foi eficiente para o diagnóstico da pitiose, apresentando especificidade semelhante à ID, todavia com melhor sensibilidade. No Brasil, o desenvolvimento de um teste de ELISA para diagnóstico de pitiose equina por Rosa et al. (1999) e de uma técnica de “ELISAconta” para detecção da soropositividade de equinos por Alves et al. (2001) também apresentaram bons resultados. Já Pinto et al. (1999) descreveram a padronização do teste de ELISA para detecção de IgG em coelhos imunizados com antígenos de P. insidiosum. Testes de ELISA para diagnóstico sorológico precoce de pitiose em caninos, humanos e bovinos também foram desenvolvidos (GROOTERS et al., 2002; KRAJAEJUM et al., 2002, PÉREZ et al., 2005), demonstrando alta sensibilidade e especificidade nestas espécies. Este teste também tem sido utilizado no diagnóstico da doença em felinos. Além de constituir-se numa poderosa ferramenta para o diagnóstico específico, também pode ser útil no monitoramento da resposta a terapia (GROOTERS, 2003).
O teste de Western Blot desenvolvido por Mendonza et al. (1992b) foi introduzido com o objetivo de identificar antígenos imunodominates de P. insidiosum durante a infecção. Esta técnica mostrou boa especificidade, sendo útil na identificação dos isótipos de imunoglobulinas em animais com doença ativa (MENDONZA et al., 1996). A utilização deste teste na pitiose bovina identificou 100% dos animais infectados (PÉREZ et al., 2005). Lübeck et al. (1999)

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desenvolveram um teste de dot-blot modificado para detecção de IgG anti-Pythium em coelhos e equinos. A técnica desenvolvida utilizou sistema de luminescência química para visualização da reação, no entanto, esta metodologia pode ser adaptada para um sistema de visualização direta em membrana, podendo ser utilizada como um teste de campo, apresentando especificidade, sensibilidade, praticidade e baixo custo.
O desenvolvimento de técnicas moleculares constitui atualmente importante ferramenta para o diagnóstico, identificação e estudos filogenéticos de P. insidiosum. Neste contexto, vários pesquisadores tem demonstrado que o seqüenciamento gênico com amplificação do RNA ribossomal, região ITS 1, através de PCR (reação de polimerase em cadeia) (GROOTERS & GEE, 2002; VANITTANAKOM et al., 2004; RODRIGUES et al., 2006, BOTTON et al., 2011) e utilização de sondas genéticas (SCHURKO et al., 2004), constituem-se em técnicas para a identificação rápida e definitiva de P. insidiosum.
O P. insidiosum difere dos fungos verdadeiros na produção de zoósporos móveis e na composição de sua parede celular. Os fungos verdadeiros possuem quitina em sua parede, enquanto o Pythium contém celulose e β-glucanas. A membrana plasmática não contém esteróides, como o ergosterol, que é o componente-alvo de ação da maioria das drogas antifúngicas (FOIL, 1996; GROOTERS, 2003). Devido a essas características, não existe droga antifúngica eficiente contra o P. insidiosum (SATHAPATAYAVONGS et al., 1989; FOIL, 1996). Os fitopatógenos do gênero Pythium são sensíveis aos inseticidas normalmente utilizados em plantas, porém esses compostos são tóxicos aos mamíferos,

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impossibilitando seu uso para o tratamento da pitiose (SATHAPATAYAVONGS et al., 1989). Um fungicida utilizado em plantas (Metalaxil) foi testado no tratamento de cães, porém com resultados pouco consistentes, em parte pela toxicidade do composto (FOIL, 1996).
O sucesso das diferentes formas de tratamento é variável e em muitos casos influenciado pelo tamanho e tempo da lesão, idade e estado nutricional do animal (SANTURIO et al., 2006). O tratamento tradicional da pitiose equina era cirúrgico, sendo o procedimento mais utilizado (MILLER, 1981); no entanto a intervenção cirúrgica é complicada devido às estruturas anatômicas envolvidas, pois a partir da permanência de fragmentos do agente podem ocorrer recidivas (MILLER, 1981; CHAFFIN et al., 1995). O tratamento cirúrgico apresenta bons resultados apenas em lesões pequenas e superficiais, onde seja possível a retirada de toda área afetada (SANTURIO et al., 2006).
No decorrer da década de 80 e 90 vários autores utilizaram a imunoterapia, cada um com suas modificações na técnica originalmente descrita. Em 1986, Mendoza & Alfaro utilizaram como antígeno apenas o sobrenadante das culturas, objetivando diminuir a reação no local de aplicação. Nesta ocasião, foram utilizados cinco animais para o teste, dos quais três foram recuperados. Mendoza et al. (1992a), compararam duas vacinas para tratamento da pitiose equina em 71 cavalos infectados. Para uma vacina foi utilizada uma massa celular como antígeno, e na outra um antígeno solúvel concentrado. As duas vacinas apresentaram resultados positivos em cavalos com lesões com menos de dois meses de evolução, com 60% e 70% de eficiência, respectivamente.

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No Brasil, o teste de eficiência de um imunobiológico (Pitium Vac®) para o tratamento da pitiose equina, produzido a partir de culturas do P. insidiosum e baseado na metodologia anteriormente descrita por Miller (1981), demonstrou índice de cura que variou de 50% a 83,3% entre os grupos tratados, independente do tempo de evolução clínica da lesão, característica ainda não observada com os outros imunoterápicos testados (MONTEIRO,1999). Santurio et al. (2003b), utilizando coelhos como modelo experimental, avaliaram a eficiência de três processos de produção de imunoterápicos contra pitiose, produzidos a partir de cultivos e submetidos aos processos de maceração e sonicação. Observaram que o imunoterápico produzido por maceração foi superior, reduzindo em até 72% a área dos nódulos cutâneos. Os resultados deste trabalho sugerem que a sonicação pode ocasionar a desnaturação dos antígenos protetores, reduzindo desta forma, a eficácia da imunoterapia.
Mendonza et al. (2003), testaram uma nova formulação de vacina para P. insidiosum em 18 equinos e 6 caninos. Esta nova formulação contendo uma mistura de exoantígenos e antígenos citoplasmáticos curou 72% dos equinos e 33% dos caninos, sugerindo que a inclusão dos antígenos citoplasmáticos aumenta as propriedades curativas do imunoterápico. Além disso, Leal et al. (2002), demonstraram que os imunoterápicos em uso podem ter sua atuação prolongada e potencializada quando utilizados com adjuvantes.
Resultados animadores da imunoterapia em humanos foram observados por Thitithanyanont et al. (1998). Após insucesso com tratamentos a base de anfotericina B, iodetos, cetoconazol e cirurgia em um menino talassêmico com

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pitiose, o uso do imunoterápico induziu a cura após duas aplicações, com intervalo de 14 dias. Wanachiwanawin et al. (2004) utilizando o imunoterápico previamente descrito, observaram que este método curou quatro de oito casos de pitiose arterial terminal em humanos na Tailândia.
Apesar dos estudos sobre a doença e a imunoterapia, ainda não há um completo conhecimento dos mecanismos envolvidos na infecção por P. insidiosum. De acordo com Miller (1981), o caráter progressivo da doença em equinos imunocompetentes sugere uma resposta imunológica inadequada ou um bloqueio na mesma. Esse autor acredita que mesmo sendo antigênicas, as hifas não são completamente reconhecidas pelo hospedeiro, devido à marcante reação inflamatória, particularmente eosinofílica. Acredita-se que os mecanismos envolvidos na cura pela imunoterapia baseiem-se principalmente na resposta celular (THITITHANYANONT et al., 1998; MENDONZA et al., 2003; WANANACHIWANAWIN et al., 2004), devido uma mudança da resposta mediada pela subpopulação de linfócitos Th2 para uma resposta mediada pela subpopulação de linfócitos Th1. Possivelmente, os antígenos presentes no imunógeno induzam esta alteração no padrão inflamatório, culminando com a cura dos animais (MENDONZA et al., 1996). Já a resposta humoral foi observada por Newton & Ross (1993) ao verificarem que o nível de anticorpos anti-Pythium aumenta em equinos doentes submetidos à imunoterapia.
No tratamento químico da pitiose equina, os fármacos mais utilizados foram a anfotericina B e os compostos iodínicos, como iodeto de potássio e sódio (McMULLAN et al., 1977; GONZALES et al., 1979; ALLISON & GILLIS, 1990;

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MEIRELES et al., 1993). McMullan et al. (1977) obtiveram 50% de eficiência associando a remoção cirúrgica e anfotericina B; 30% apenas com anfotericina B e 20% não responderam aos tratamentos. Little & Kabay (1984) e Chaffin et al. (1992) relataram o sucesso do tratamento cirúrgico seguido de iodeto de sódio em potros com pitiose cutânea. Entretanto, Meireles et al. (1993) não obtiveram sucesso em dois equinos tratados com iodeto de potássio endovenoso, até mesmo quando associado à cirurgia. Utilizando outras tentativas de tratamento, Sedrish et al. (1997) obtiveram sucesso no uso de raio laser vermelho de alumínio, neodímio e ítrio como terapia suplementar após a remoção cirúrgica de lesões de pitiose equina. Porém, alguns autores afirmam que a ressecção cirúrgica total do granuloma combinada com imunoterapia especifica para P. insidiosum seria o tratamento mais indicado para cura de pitiose em equinos (HUBERT & GROOTERS, 2002).
Até o presente momento, nenhuma das terapias antifúngicas propostas para a pitiose canina apresentaram resultados satisfatórios. Entre as drogas testadas destacam-se a anfotericina, fluconazol, cetoconazol e itraconazol (FOIL et al., 1984; ENGLISH & FROST, 1984; DYKSTRA et al., 1999, JAEGER et al., 2002; RIVIERRE et al., 2005). Segundo alguns autores, a cirurgia continua como opção mais segura para o tratamento da pitiose canina (HNILICA, 1998, THOMAS & LEWIS, 1998; GROOTERS, 2003). Entretanto, Grooters (2003) cita que as recidivas pósoperatórias são frequentes. Este mesmo autor relata que aproximadamente 15% dos cães com pitiose gastrointestinal responderam ao tratamento com itraconazol ou anfotericina B lipídica. Também observou melhora ou cura clínica e sorológica em alguns casos de pitiose cutânea canina e felina tratados com a associação antifúngica terbinafina-itraconazol. Afirma que, embora o número de animais que

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responderam a este protocolo de tratamento tenha sido baixo, a combinação antifúngica pareceu superior à terapia isolada.
O tratamento da pitiose felina também apresenta resultados variados. Bissonnette et al. (1991) realizaram o tratamento de um felino com pitiose nasal e retrobulbar com cetoconazol, e observaram que houve melhora clínica, porém a lesão recidivou após o término do tratamento. Já Rakich et al. (2005) obtiveram resultados diferentes ao tratar dois felinos com pitiose gastrointestinal. O animal tratado com a associação terbinafina/itraconazol, durante dois meses após retirada cirúrgica da lesão, apresentou cura clínica sem recidivas. Porém, morreu subitamente quatro meses após a cirurgia. O outro felino, que recebeu terapia com itraconazol, também por dois meses após retirada cirúrgica da lesão, demonstrou sorologia negativa, detectada por meio de um teste de ELISA, realizado cinco meses após tratamento. Este animal permaneceu em observação por nove meses, não apresentando recidiva da lesão durante esse período.
A tendência ao tratamento da pitiose atualmente está voltada para os chamados inibidores de síntese de glucanas, como a caspofungina (KRAJAEJUN et al, 2006). Acredita-se que esta droga seja eficiente contra este agente devido a grande quantidade de β-glucana presente na parede celular deste oomiceto (GROOTERS, 2003). Alguns estudos demonstraram a suscetibilidade de P. insidiosum à caspofungina determinando a concentração inibitória mínima desta droga (PEREIRA et al. 2007, BROWN et al., 2008). Pereira et al. (2007) avaliaram a suscetibilidade in vitro de 27 isolados de P. insidiosum frente à caspofungina e ainda relacionaram estes achados com a resposta da terapia in vivo em coelhos com pitiose experimental. Entretanto, este estudo sugeriu que P. insidiosum é

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pouco suscetível à caspofungina in vitro e in vivo. Alguns autores relataram que o crescimento paradoxal de isolados de C. albicans pode ocorrer em concentrações elevadas de caspofungina, e este fenômeno tem sido registrado com diversas espécies de Candida (STEVENS et al, 2004;. PERLIN, 2007). Além disso, o crescimento paradoxal também foi descrito em espécies de Aspergillus (SÓCZÓ et al., 2007).
De forma similar aos resultados clínicos, os testes de sensibilidade in vitro com antifúngicos, realizados com P. insidiosum, também tem demonstrado resultados contraditórios. Em um estudo de Sekhon et al. (1992) os poliênicos (anfotericina B, hamycin e seus análogos) não apresentaram atividade satisfatória, enquanto os azólicos (fluconazol, cetoconazol e miconazol) inibiram os isolados de P. insidiosum testados in vitro, com o miconazol apresentando os melhores resultados, seguido do cetoconazol. Entretanto, Triscott et al. (1993), relatando pitiose subcutânea na região periorbital de dois jovens, constataram a boa resposta ao tratamento com anfotericina B, contrariando os resultados obtidos nos testes de sensibilidade. Em outro estudo, as drogas anfotericina B, flucitosina, miconazol e griseofulvina não inibiram o crescimento do fungo, enquanto o itraconazol apresentou atividade moderada e a terbinafina foi ativa contra o P. insidiosum testado (SHENEP et al., 1998).
As indicações para a utilização dos diferentes antifúngicos devem ser baseadas nos resultados obtidos com os estudos de suscetibilidade disponíveis, os quais podem oferecer informações para escolha do tratamento mais adequado (CUENCA-ESTRELLA & RODRÍGUEZ-TUDELA, 2002). Os padrões do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) constituem os métodos de referência

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mais difundidos e os que mais se tem utilizado para realizar estudos de correlação com a clínica (CUENCA-ESTRELLA & RODRÍGUEZ-TUDELA, 2002). O documento M 38-A2 é um dos métodos de referência do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, formalmente National Committee for Clinical Laboratory Standards-NCCLS). M 38-A2 é uma norma global desenvolvida, mediante processo consensual do CLSI, para testes de diluição em caldo com a finalidade de determinar a suscetibilidade in vitro de fungos filamentosos à terapia antifúngica (CLSI, 2008). Este documento apresenta a seleção de agentes antifúngicos; preparação de soluções antifúngicas padrão e diluições para a realização de testes; e os requisitos de controle de qualidade para testes de sensibilidade de fungos filamentosos que causam infecções fúngicas invasivas.
Os resultados positivos obtidos com terapias utilizando terbinafina e itraconazol são inesperados, uma vez que estes antifúngicos atuam na síntese do ergosterol. O itraconazol é um triazólico que apresenta atividade antifúngica contra espécies de Candida, Cryptococcus neoformans, Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum, Coccidiodis immitis, Paracoccidiodis brasiliensis e dermatófitos. O seu mecanismo de ação consiste na inibição da lanosina 14 αdesmetilase, um sistema de enzimas microssômicas dependentes do citocromo P450, responsável pela conversão do lanosterol em ergosterol. Por isso, comprometem a biossíntese do ergosterol na membrana citoplasmática e levam ao acúmulo de 14 α metilesteróis, os quais podem desagregar o arranjo compacto das cadeias acíclicas dos fosfolipídios, comprometendo as funções de determinados sistemas enzimáticos ligados a membrana, como ATPase e as enzimas de transporte de elétrons, inibindo assim, o crescimento dos fungos. O itraconazol é

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administrado por via oral e, após absorção, sofre extenso metabolismo hepático. É altamente lipossolúvel, com meia vida de 36 horas, sendo excretado na urina (BENNET, 2003).
A terbinafina é um antifúngico oral ou tópico usado para tratar dermatofitose, e tem sido avaliado também em combinações com outros agentes (VAZQUEZ, 2003). Terbinafina é um composto fungicida queratinofílico, altamente lipofílico, pertencente ao grupo das alilaminas (COSTA & GÓRNIAK, 2002). É altamente efetiva contra dermatófitos in vitro e in vivo (DAVIS & BALFOUR, 1995; GHANNOUM & RICE, 1999), bem como contra fungos filamentosos, dimórficos e dematiáceos, e algumas espécies de leveduras (BALFOUR & FAULDS, 1992). Atua especificamente em uma etapa precoce da biossíntese do ergosterol (GHANNOUM et al., 1999), inibindo a enzima esqualeno-epoxidase, levando a deficiência de esterol na membrana celular fúngica e acúmulo intracelular tóxico de esqualeno (N’DIAYE et al., 2006), resultando em morte celular. Também é metabolizada no fígado pelo sistema citocromo P-450 e os metabólitos são excretados na urina (BENNET, 2003). Tem sido usada contra dermatófitos, mas estudos indicaram uma atividade elevada de terbinafina in vitro contra uma grande variedade de fungos invasivos, tais como espécies de Candida, espécies de Aspergillus ou Penicillium marneffei (RYDER et al., 1998; MOORE et al., 2001).
O desenvolvimento de inibidores da β (1,3)-D-glucana sintetase, envolvida na síntese da glucana da parede celular fúngica, representa um importante avanço na quimioterapia antifúngica. A caspofungina é um lipopeptídio anfipático solúvel em água (DERESINSKI & STEVENS, 2003). O seu mecanismo de ação consiste no bloqueio da síntese de β(1,3)-D-glucana da parede celular fúngica por inibição não

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competitiva da enzima β(1,3)-D-glucana sintetase, a qual é indispensável para síntese da parede fúngica (MASCHMEYER & GLASMACHER, 2005; DATRY & BART-DELABESSE, 2006). As cadeias de β(1,3)-D-glucana formam uma sólida matriz tridimensional, constituindo-se no maior componente da parede fúngica que promove integridade estrutural e estabilidade osmótica na maioria dos fungos patogênicos (GONZÁLEZ et al., 2001; LETSCHER-BRU & HERBRECHT, 2003). A inibição da síntese de β(1,3)-D-glucana produz um duplo efeito, fungistático e fungicida. O efeito fungistático resulta do bloqueio da síntese da parede celular, reduzindo assim o crescimento fúngico. Já o efeito fungicida, resulta de uma mudança na integridade da parede celular, a qual perde sua resistência mecânica tornando-se incapaz de resistir à pressão osmótica interna, cujo resultado é a destruição da célula fúngica (LETSCHER-BRU & HERBRECHT, 2003). Como esta enzima não existe nas células dos mamíferos, este modo de ação é único e específico na célula fúngica, eliminando-se assim, a toxicidade para os animais e humanos (PEREIRA, 2008).
A caspofungina apresenta atividade in vitro contra espécies de Candida, incluindo amostras resistentes a anfotericina B e fluconazol; Aspergillus spp. e outros fungos clinicamente importantes como gêneros de Alternaria, Curvularia, Paecilomyces variotii, Scedosporium apiospermum e fungos dimórficos. Entretanto, apresenta pouca atividade contra Cryptococcus neoformans, Trichosporum spp., Rhizopus arrhizus e Fusarium spp (GONZÁLEZ et al., 2001). Atividade fungicida tem sido observada em Candida spp, enquanto que estudos in vitro tem demonstrado efeito fungistático em Aspergillus spp. (LETSCHER-BRU & HERBRECHT, 2003). Em humanos, tem sido demonstrada eficácia clínica contra

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infecções causadas por Candida e Aspergillus, estando a caspofungina licenciada para o tratamento de aspergilose invasiva em pacientes que são refratários ou intolerantes a outras terapias, candidemias ou outras infecções causadas por Candida (KARTSONIS et al., 2003).
Estudos de farmacocinética tem demonstrado que caspofungina não é absorvida por via oral, devendo ser administrada em infusão endovenosa. No plasma sanguíneo encontra-se altamente ligada a proteínas plasmáticas, principalmente albumina (96%). A distribuição, e não a excreção ou a biotransformação, constitui o mecanismo predominante que influencia as depurações plasmáticas, ocorrendo pouca excreção ou biotransformação nas primeiras 30 horas após a administração. Hadju et al. (1997), estudando a farmacocinética da droga em camundongos, observaram que as concentrações no fígado, baço e rins foram marcadamente mais altas que as concentrações plasmáticas e Groll et al. (2001), avaliando o comportamento de caspofungina em coelhos, constataram que esta foi bem tolerada, atingindo concentrações plasmáticas que alcançaram ou excederam as concentrações inibitórias mínimas. As equinocandinas são degradadas lentamente no fígado por hidrólise e Nacetilação, sendo o metabolismo de ação independente do sistema enzimático citocromo P-450. Não há formação de metabólitos ativos, sendo mínima a excreção renal de droga ativa (MASCHMEYER & GLASMACHER, 2005).
Vários estudos in vitro tem explorado as interações entre compostos antifúngicos e outras classes de agentes antimicrobianos, demonstrando sinergismo entre agentes antifúngicos e não antifúngicos, como o ibuprofeno e a fluvastatina, contra algumas espécies fúngicas. Combinações de antifúngicos com

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inibidores da bomba de prótons, antiarrítmicos, agentes redutores de colesterol, imunomoduladores, compostos antineoplásicos e antiparasitários tem sido explorados (CUENCA-ESTRELLA, 2004).
O ibuprofeno é um antiinflamatório derivado do ácido propiônico, inibindo a cicloxigenase-1 (COX-1) e a cicloxigenase-2 (COX-2), na mesma proporção e de forma irreversível, além de também inibir a ativação e a agregação de neutrófilos, a geração de radicais livres (agindo sobre as cininas e histamina na mediação da inflamação) e a liberação de enzimas lisossomais (SPINOSA et al., 2002). Possui ainda ação analgésica e antipirética. É rapidamente absorvido após administração oral e o tempo de meia-vida é de duas horas. Liga-se amplamente às proteínas plasmáticas, geralmente em proporções superiores a 90%. A via de eliminação é principalmente renal, devendo-se ter precaução quando há comprometimento da função renal. Efeitos tóxicos podem ser observados em cerca de 5 a 15% dos pacientes, compreendendo, principalmente, dor ou desconforto epigástrico, náuseas, vômitos, diarréia, sensação de plenitude gastrintestinal e constipação (SILVA, 2006).
A fluvastatina é uma estatina lipofílica e exerce seu efeito principal no fígado. É um agente redutor de colesterol, totalmente sintético, inibindo competitivamente a enzima HMG-CoA (hidroxi-3-methyl-glutaril-CoA) redutase, que é responsável pela conversão da HMG-CoA em mevalonato, um precursor de esteróis, inclusive do colesterol. A inibição da biosíntese do colesterol reduz o colesterol nas células hepáticas, o que estimula a síntese dos receptores das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e, portanto, aumenta a captação das partículas de LDL. O resultado final desses mecanismos é a redução da

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concentração plasmática de colesterol (CHIN et al, 1997). Também, diminui a migração e proliferação das células musculares lisas na parede arterial. Evidentes alterações na resposta inflamatória têm sido relatadas com o uso das estatinas, incluindo a inibição das citocinas, proteina-C reativa, expressão das metaloproteinases da matriz e diminuição na adesão de monócitos na célula endotelial. Estudos recentes, relativos às propriedades pleiotrópicas das estatinas, têm revelado sua capacidade de inibir a síntese de importantes intermediários dos isoprenoídes, que servem como ligações para uma variedade de proteínas implicadas na sinalização intracelular. De outro lado, estudos bem conduzidos tem revelado uma diferença na potência de ação das estatinas em reduzir o colesterol e as LDL plasmáticas, discutindo-se ainda um diferencial nos seus efeitos pleiotrópicos e uma suposta seletividade tissular (JORGE et al, 2005).
Tendo em vista a quantidade de agentes antifúngicos sistêmicos disponíveis, uma opção para o tratamento é a terapêutica combinada. A combinação de dois medicamentos diferentes que exercem seus efeitos através de dois mecanismos diferentes, poderia evitar o aparecimento de resistência medicamentosa e ampliar o espectro da atividade da associação. Além disso, as combinações antifúngicas permitem o uso de doses mais baixas de cada composto, reduzindo o risco de efeitos tóxicos destes (ZHU et al., 2004).
Segundo Johnson (2004), as vantagens dos testes de associações antifúngicas in vitro são: a facilidade de se avaliar grande número de concentrações; aplicabilidade de testes estatísticos; facilidade para variar fatores técnicos; facilidade para testar múltiplos isolados; facilidade para testar cepas com tipo de resistência definido. E entre as desvantagens o autor cita que a relevância

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dos métodos nem sempre é clara, e que fatores do hospedeiro e a farmacocinética são ignorados.
Uma das formas mais conhecidas e mais simples para avaliar efeitos de combinações in vitro é através da técnica de checkerboard. O termo checkerboard se refere a um modelo, utilizando tubos ou placas de microtitulação, formado para testar dois agentes antifúngicos em várias diluições acima e abaixo da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para o fungo a ser testado (CUENCAESTRELLA, 2004). O Índice de Concentração Inibitória Fracionária (ICIF) é a forma mais comum em micologia médica para relatar resultados de estudos com o método checkerboard, e é a concentração mais baixa de cada fármaco capaz de inibir o crescimento do micro-organismo (CUENCA-ESTRELLA, 2004). O método checkerboard utiliza o ICIF para demonstrar quantitativamente que combinações de dois agentes podem apresentar efeitos inibitórios que são maiores (sinergismo) ou menores (antagonismo) que a soma dos seus efeitos individuais (ODDS, 2003). As interações são interpretadas como sinérgicas (ICIF ≤ 0,5), indiferentes (0,5 < ICIF ≤ 4) ou antagônicas (ICIF > 4) e calculadas de acordo com a fórmula: ICIF = (CIM A em combinação/CIM A) + (CIM B em combinação/CIM B) (JOHNSON et al, 2004) ou ICIF = (CIM A em combinação/CIM A) + (CIM B em combinação/CIM B) + (CIM C em combinação/CIM C) (DANNAOUI et al, 2004).

3. ARTIGOS CIENTÍFICOS

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ARTIGO 1

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In vitro paradoxical growth of Pythium insidiosum in the presence of caspofungin
Artigo publicado na revista Veterinary Microbiology

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ARTIGO 2

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In vitro and in vivo susceptibility of two-drug and three-drug combinations of terbinafine, itraconazole, caspofungin, ibuprofen and fluvastatin against Pythium insidiosum
Artigo publicado na revista Veterinary Microbiology

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FIGURA SUPLEMENTAR DO ARTIGO 2 (NÃO INCLUÍDA PARA PUBLICAÇÃO)
Figure 1. Percent variation of subcutaneous lesioned areas in rabbits experimentally inoculated with Pythium insidiosum and treated with a combination of terbinafine and itraconazole (group 1); terbinafine, itraconazole and fluvastatin (group 2); terbinafine and caspofungin (group 3), or control (group 4).

4. DISCUSSÃO

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A falta de uma terapia adequada para pitiose tem incentivado a busca de novas propostas. Baseados em estudos in vitro focando diferentes antimicóticos ou agentes antifúngicos combinados a não-antifúngicos, nós investigamos a eficácia de várias combinações de fármacos contra P. insidiosum.
Isolados de P. insidiosum apresentaram diferentes graus de sensibilidade ao ibuprofeno, a estatina e aos agentes antifúngicos. Os agentes não-antifúngicos mostraram fraca atividade antifúngica contra P. insidiosum quando testados sozinhos. Quando os agentes não-antifúngicos foram testados em combinação com antifúngicos, a CIM foi menor do que as CIMs individuais. As CIMs de ibuprofeno isoladamente e em combinação com outros fármacos variaram de 128 a 1024 mg/l e 2 a 256 mg/l, respectivamente. As CIMs individuais da fluvastatina variaram de 32 a >128 mg/l, enquanto que as CIMs da fluvastatina em todas as combinações testadas variaram de 1 a >64 mg/l. Estudos anteriores mostraram que uma concentração de 1 mg/l de fluvastatina é clinicamente relevante (NASH et al., 2002).
Concentrações de fluvastatina entre 64 e 128 mg/l causaram uma inibição do crescimento de 100% (sem crescimento visível) para Candida albicans, Candida tropicalis e Candida parapsilosis (CHIN et al., 1997). Além disso, em outro estudo a fluvastatina demonstrou uma CIM acima de 2 mg/l contra oito isolados de C. albicans quando esta estatina foi avaliada em combinação com fluconazol (NASH et al., 2002). Esses autores também sugeriram que a ausência

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de sinergismo entre fluconazole e fluvastatina foi devido à baixa concentração de fluvastatina utilizada no estudo.
A fluvastatina, fármaco redutor de colesterol, tem sido relatada com interações sinérgicas com azóis contra Candida spp. e fungos filamentosos (CHIN et al., 1997). O mecanismo da atividade antifúngica, no entanto, não é claro. Combinações de estatinas e itraconazol também foram testados contra espécies de Aspergillus spp., mas as CIMs das estatinas foram extremamente elevadas (4 a >256 mg/l) e superou as concentrações plasmáticas encontradas em doses clínicas (QIAO et al., 2007).
O ibuprofeno possui uma potente atividade fungicida, causando lesões da membrana e bloqueio de bombas de efluxo; no entanto, baixas concentrações de ibuprofeno são fungistáticas (PINA-VAZ et al, 2005). Em vários estudos sobre a combinação de fluconazol e ibuprofeno foi observado um efeito sinérgico, principalmente em isolados de C. albicans resistentes ao fluconazol (PINA-VAZ et al, 2005; ARAI et al, 2005); entretanto, não há muitos dados sobre as possíveis interações entre fluconazol e anti-inflamatórios não-esteroidais (HYNNINEN et al., 2006).
A associação terbinafina + ibuprofeno foi indiferente para 93,3% dos isolados estudados. Cavalheiro et al. (2009b) mostraram resultados similares para metronidazol, rifampicina, ibuprofeno, fluvastatina e anfotericina B isoladamente ou em associação dupla com terbinafina. Curiosamente, Cavalheiro et al. (2009b) encontraram 41,18% e 17,65% de sinergismo para as combinações de terbinafina e anfotericina B ou ibuprofeno, respectivamente. Ainda neste estudo, a combinação de terbinafina e fluvastatina mostrou antagonismo e indiferença, mas

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não sinergismo (CAVALHEIRO et al., 2009b), o que difere do presente estudo, no qual um isolado teve resultado sinérgico e não foi observado antagonismo.
Em outro estudo, Cavalheiro et al. (2009a) encontraram 41,18% de sinergismo para a combinação de terbinafina e caspofungina. De acordo com este achado, o presente estudo constatou que a combinação de terbinafina e caspofungina teve efeito sinérgico em mais de 45% das amostras. Os diferentes mecanismos de ação das equinocandinas e alilaminas tornam estes agentes antifúngicos prováveis candidatos para uso em combinações terapêuticas, pois as equinocandinas inibem a síntese de 1,3-β-D-glucana e as alilaminas, a síntese de ergosterol, inibindo esqualeno epoxidase (GHANNOUM & RICE, 1999). Embora nós tenhamos encontrado efeitos sinérgicos em 40% dos isolados frente a combinação de terbinafina mais itraconazol, em um outro estudo com a mesma associação utilizando uma técnica de macrodiluição foi observado sinergismo somente em 17% dos isolados (ARGENTA et al., 2008).
Ainda, no presente estudo, foi observado o efeito paradoxal de alguns isolados de P. Insidiosum frente a caspofungina quando testada isoladamente. No entanto, Brown et al. (2008) não observaram crescimento paradoxal de P. insidiosum testando caspofungina através de um ensaio de crescimento radial. Atualmente, o efeito paradoxal tem sido descrito apenas para espécies de Candida e Aspergillus. O mecanismo que provoca o crescimento paradoxal permanece desconhecido (STEVENS et al., 2005). Alguns autores tem sugerido regulação compensatória da síntese de componentes da parede celular como um possível mecanismo (STEVENS et al., 2004), porque altas concentrações de caspofungina parecem estimular a produção de quitina em fungos.

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Perlin (2007) observaram um aumento (898%) na concentração de quitina na parede celular de uma cepa de C. albicans, que mostrou crescimento paradoxal. Este aumento parece ser um mecanismo para compensar a redução de β-1,3 e β-1,6 glucanas devido à ação da caspofungina. No entanto, a quitina não está presente na parede celular de Pythium spp.(ALEXOPOULOS et al., 1996). Portanto, provavelmente há estimulação de outro componente celular, como celulose, que é o componente principal da parede celular deste oomiceto (ALEXOPOULOS et al., 1996).
A ocorrência do crescimento paradoxal em alguns isolados de P. insidiosum e sua ausência em outros pode ser explicada pelo efeito isolado-dependente. Cantón et al. (2007) relataram que o crescimento paradoxal de isolados de Candida spp é mais evidente quando o caldo RPMI 1640 é o meio de cultura. Além disso, a frequência do efeito paradoxal foi dependente da espécie, da amostra e do meio. Nenhum efeito do tempo de incubação tem sido relatado.
As habilidades de subpopulações sobreviver em concentrações elevadas do fármaco poderiam ter consequências in vivo (STEVENS et al., 2004). O significado in vivo do efeito paradoxal permanece incerto, uma vez que os níveis de droga necessários excedem os níveis normais de dosagem (PERLIN, 2007). Tem sido sugerido que a ação cooperativa de caspofungina e uma segunda droga pode erradicar o efeito paradoxal (STEVENS et al. 2004, PERLIN, 2007).
No presente trabalho, o qual descreve os primeiros resultados do uso de antifúngicos e não-antifúngicos em combinações triplas contra o P. insidiosum in vitro e in vivo, as combinações triplas testadas exibiram um efeito sinérgico e indiferença contra os isolados estudados. As estatinas tem exercido potente

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atividade antifúngica contra uma grande variedade de patógenos fúngicos clinicamente importantes (NYILASI et al., 2010), e a combinação de fluvastatina com terbinafina, itraconazol ou caspofungina resultou em efeitos sinérgicos. A extensão da inibição foi maior quando a terbinafina, itraconazol e fluvastatina foram aplicados em conjunto. Na verdade, a combinação de terbinafina, itraconazol e fluvastatina foi sinérgica contra 20% dos isolados, sendo a segunda combinação tripla mais eficaz.
A Cmax para a fluvastatina após doses de 20-40 mg/dia variou entre 100300 ng/ml no plasma (NASH et al., 2002). Curiosamente, um estudo anterior descobriu que a concentração de outras estatinas necessárias para inibir o crescimento de Aspergillus fumigatus foi maior do que a concentração terapêutica (58 mg/l para a atorvastatina e de 0,4 mg/l de sinvastatina) (QIAO et al., 2007).
O experimento in vivo foi desenvolvido com base nos melhores resultados do estudo prévio in vitro que avaliou várias combinações de tratamentos. Combinações de drogas que incluíam o ibuprofeno não foram utilizadas nos coelhos devido a gastrite severa que é causada por doses repetidas dessa droga (HYNNINEN et al., 2006).
Embora as análises morfométricas demonstraram que as lesões nos coelhos do grupo controle apresentou um maior número de hifas em comparação com as lesões nos coelhos dos grupos tratados, apenas um coelho no grupo tratado com terbinafina, itraconazol e fluvastatina foi curado (ie, desaparecimento completo da lesão no momento da necropsia). Em parte, este resultado pode ser explicado pelos níveis plasmáticos de terbinafina e itraconazol (HURTADO et al., 2009), que foram muito abaixo dos níveis desejados. Além disso, estudos

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demonstraram que o tratamento com uma combinação de terbinafina e itraconazol curou uma criança com pitiose oftálmica (SHENEP et al, 1998;. SUDJARITRUK & SIRISANTHANA, 2011). Os níveis séricos de itraconazol após o tratamento com terbinafina e itraconazol variou de 1,0 µg/ml a 2,1 µg/ml após uma dose oral de 8 mg/kg/dia (SHENEP et al., 1998). Outro estudo demonstrou que a administração oral de terbinafina, uma solução saturada de iodeto de potássio e anfotericina B foi utilizada com sucesso para tratar a forma cutânea de pitiose (LAOHAPENSANG et al., 2009).
Embora Pereira et al. (2007) tenham demonstrado a atividade fungistática da caspofungina em coelhos com pitiose experimental, a combinação de terbinafina e caspofungina in vivo não havia sido investigada anteriormente. Os resultados deste estudo nos levou a investigar a combinação de terbinafina e caspofungina em coelhos. No entanto os resultados não foram os esperados.

5. CONCLUSÕES

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1. A terbinafina testada individualmente mostrou-se fungicida in vitro, mas os demais fármacos testados sozinhos não evidenciaram atividade fungicida frente aos isolados de P. insidiosum estudados;
2. A caspofungina demonstrou crescimento paradoxal em alguns isolados de P. insidiosum em testes de suscetibilidade, não apresentando o mesmo efeito quando este fármaco foi testado em associações com outros fármacos;
3. Nas associações duplas in vitro obteve-se a maior eficácia quando se testou terbinafina+caspofungina e itraconazol+ibuprofeno e nas combinações triplas quando se testou terbinafina, itraconazol e ibuprofeno, seguida da associação de terbinafina, itraconazol e fluvastatina;
4. Houve fraca correlação entre os achados in vitro e in vivo, onde apenas um coelho, tratado com a associação terbinafina, itraconazol e fluvastatina, obteve cura clínica confirmada pelo desaparecimento da lesão após necropsia.

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REFERÊNCIAS
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